食用油DNA提取方法及轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、從古至今，植物源性食用油一直是人類得以健康生活的保證。近年來，許多農(nóng)業(yè)公司利用包括轉(zhuǎn)基因技術(shù)在內(nèi)的現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)新的植物品系。由于轉(zhuǎn)基因植物存在的安全性問題使得轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的標(biāo)簽問題成為公眾關(guān)注的主要熱點(diǎn)，已有30多個(gè)國家制定了相應(yīng)的法律法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其衍生產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)簽。目前，許多未經(jīng)標(biāo)簽和認(rèn)證的轉(zhuǎn)基因生物及其深加工產(chǎn)品可能已經(jīng)進(jìn)入中國市場(chǎng)，這就迫切地需要合適的檢測(cè)手段以確定這些食品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。 以油脂為材料提取

2、 DNA 進(jìn)行分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵是能否提取到高質(zhì)量的油脂DNA。自DNA分析技術(shù)興起后，國內(nèi)外在這方面做出了巨大的成就，發(fā)展了多種轉(zhuǎn)基因食品DNA檢測(cè)方法。但仍存在以下問題：①各種提取方法通用性不好。在許多實(shí)驗(yàn)中存在擴(kuò)增成功率在物種和食品種類之間的差異。雖然專用DNA提取試劑盒有較好的通用性，但昂貴的價(jià)格限制了該試劑盒的廣泛應(yīng)用，因此構(gòu)建一套效果好、通用性好、性價(jià)比高的油脂DNA提取方法，可以大大推進(jìn)油脂DNA技術(shù)的推廣。②對(duì)外源基因

3、最佳PCR檢測(cè)方法的摸索，檢驗(yàn)靈敏度和效率都不高。 本文以4種植物油為材料，分別構(gòu)建了2種新的DNA提取方法解決現(xiàn)存的問題；分別用普通PCR和降落PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分，并對(duì)其反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，主要結(jié)果如下： 1、本論文中構(gòu)建的改進(jìn)型CTAB提取方法廣泛適用于各種植物油DNA提取，僅一次提取即得到高質(zhì)量的模板DNA，成功率高，一般不需重復(fù)提取，對(duì)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果也證實(shí)了方法的可靠性和通用性。雖然有些公司的油脂DN

4、A提取專用試劑盒也有著較好的通用性，但其昂貴的價(jià)格(25元/次)使其在大量分析樣品時(shí)受到很大的限制。與之相比，本方法成本低廉，每提取一個(gè)樣品的成本低于 3 元，用實(shí)驗(yàn)室常用試劑即可完成油脂DNA提取，同時(shí)產(chǎn)物純度高于專用試劑盒。即擁有超過專業(yè)試劑盒的提取效果，又盡可能的降低了實(shí)驗(yàn)成本，真正實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室通用性，有利于油脂DNA技術(shù)的迅速推廣。 2、本研究中還利用快速蛋白液相色譜法(Fast protein liquid chrom

5、atographyFPLC)，通過陰離子交換柱分離純化DNA，提高了產(chǎn)物的純度，關(guān)鍵是可以把完整基因組DNA與DNA片斷分開，同時(shí)節(jié)省了提取時(shí)間，回收率高，適宜少量樣品的快速DNA提取。 3、通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)普通PCR法檢測(cè)外源基因進(jìn)行分析，得出以下最佳反應(yīng)條件：①M(fèi)g<,2+> 濃度為 2.5mmol/L、引物濃度為 0.1μmol/L．至0.4μmol/L、dNTPs 濃度200μmol/L，Taq酶添加量為5U。最佳退火溫度