基于微陣列的多重核酸檢測新技術的開發(fā)及其在轉(zhuǎn)基因作物檢測中的應用研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因作物在全球的迅速發(fā)展，越來越多的轉(zhuǎn)基因作物被批準進入市場，其外源插入片段的組成也愈加復雜化和多樣化，同時，市場上未批準轉(zhuǎn)基因作物的非法流通、作物及產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的低水平混雜時有發(fā)生，這對當前轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的檢測提出了很高的要求，亟需能同時檢測大量靶標、快速高效、操作簡單、經(jīng)濟的檢測方法。然而目前轉(zhuǎn)基因成分的多重檢測方法面臨諸多問題和挑戰(zhàn)，如可并行檢測的靶標數(shù)目較少、擴增與檢測分開使得檢測步驟多耗時長、缺乏便攜式檢測平臺等。

2、另一方面，多重核酸檢測在其它諸多領域如疾病診斷、微生物檢測、食品安全以及環(huán)境監(jiān)測等方面也有著迫切的需求，而轉(zhuǎn)基因多重檢測面臨的問題其實也是當前整個多重核酸檢測領域面臨的共性問題。針對上述問題，在本論文的研究中，我們以引物及反應的物理隔離為指導思想，在多個平臺上成功構(gòu)建了一整套基于微陣列的多重核酸擴增及檢測新技術，將這些方法成功應用于轉(zhuǎn)基因作物的高通量檢測中，一定程度上解決了當前轉(zhuǎn)基因作物檢測面臨的主要問題,同時也為當前整個多重核酸檢測領

3、域提供了一種新的解決方案。
　　首先，為了提高轉(zhuǎn)基因多重檢測中可并行檢測的靶標數(shù)目，本論文以本實驗室發(fā)明的一套基于親疏水微孔陣列芯片的多重PCR方法為基礎，設計開發(fā)了一套用于轉(zhuǎn)基因靶標多重并行擴增的芯片多重PCR平臺和一張用于識別多種轉(zhuǎn)基因靶標分子的DNA芯片，將二者相結(jié)合，建立了一套目前世界上最高通量的轉(zhuǎn)基因檢測平臺MACRO(Multiplex Amplification on a Chip with Readout on a

4、n Oligo microarray)，能夠在一次反應中同時檢測91種轉(zhuǎn)基因相關靶標，檢測范圍覆蓋到超過97%的現(xiàn)有商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物品系。同時，用多種模擬樣本和實際樣本進行測試的結(jié)果表明本方法的特異性接近100%，靈敏度滿足轉(zhuǎn)基因日常檢測的實際要求，實驗室自配復雜樣本和海關抽檢盲樣的檢測結(jié)果分別與理論預期和當前轉(zhuǎn)基因檢測的金標準real-time PCR方法檢測的結(jié)果100%一致。本方法是世界上第一個可全局性監(jiān)測轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的多重檢

5、測方法，對日常轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的檢測和監(jiān)管有著重要的實際意義。
　　接著，針對當前方法中擴增及檢測分開增加了操作步驟和檢測時間的問題，本論文進一步對MACRO技術平臺進行了改進，建立了集擴增與檢測于一體的FLAC（Fluorescent-Labeled Amplification and analysis on Chip）多重檢測平臺。我們采用TaqMan probe技術，對芯片PCR產(chǎn)物進行熒光標記，同時在芯片PCR后用蓋片的簡

6、單方式對芯片進行封閉，使得芯片PCR后可以直接通過芯片掃描儀讀取熒光信號，實現(xiàn)了芯片PCR產(chǎn)物的在片檢測，使原本的檢測時間縮短了一半以上。我們將此方法用于轉(zhuǎn)基因檢測中，選擇了一些重要的的高頻轉(zhuǎn)基因元件以及轉(zhuǎn)基因作物的植物內(nèi)源參照基因進行測試，成功實現(xiàn)了對19種轉(zhuǎn)基因相關靶標的一次性并行快速檢測，結(jié)果初步表明本方法具有很高的特異性和靈敏度。
　　最后，為了提高多重核酸檢測的便攜性，本論文利用和前述方法中同樣的引物及反應物理隔離的思路

7、，設計制作了一種集成毛細管陣列的多重微反應器，并在此基礎上結(jié)合可視化LAMP技術，開發(fā)了一套簡單快速且經(jīng)濟的便攜式多重核酸可視化檢測平臺CALM（Capillary Array-based LAMP for Multiplex visual detection of nucleic acids）。在該方法中，我們通過特殊的毛細管微陣列設計和親疏水處理，同時對加樣裝置進行了巧妙的設計，可以用移液器一次性將反應液非常方便地加入所有毛細管中并

8、同步進行擴增及檢測。本方法能在半小時到一小時之內(nèi)完成反應及檢測，且結(jié)果可直接肉眼檢測，無需配套檢測設備。本平臺簡單便攜、對儀器和電力依賴低，未來有望用于現(xiàn)場實時檢測（point of care test，POCT）等領域。在本論文中，我們同樣將此方法應用于轉(zhuǎn)基因檢測，成功實現(xiàn)了對8種常見轉(zhuǎn)基因相關靶標的快速可視化多重檢測。模擬樣本和實際樣本測試的結(jié)果表明本方法具有很高的特異性、靈敏度、準確度和實用性。
　　綜上所述，本論文針對轉(zhuǎn)基

9、因作物檢測和整個多重核酸檢測領域面臨的問題和挑戰(zhàn)，以多種形式的微陣列為載體、以引物及反應的物理隔離為指導思想，建立了一整套簡便通用的多重核酸檢測方法，這些方法可大大提高多重核酸檢測的重數(shù)，同時又兼具高特異性和靈敏度、方法簡便、靈活、通用等優(yōu)點。所有這些方法均被成功地應用于對多重核酸檢測有著迫切需求的轉(zhuǎn)基因作物檢測中，顯示了良好的效果和相比其它傳統(tǒng)檢測方法的優(yōu)勢，因此，這些方法在轉(zhuǎn)基因檢測領域有著現(xiàn)實的應用價值，同時也為當前多重核酸檢測領