太赫茲光譜技術(shù)在核酸檢測上的應(yīng)用研究.pdf

1、背景：太赫茲（terahertz，THz）波是指頻率在0.1—10THz（1THz=1012Hz）范圍的電磁波。由于生物大分子內(nèi)和分子間的弱相互作用力和骨架振動和偶極子旋轉(zhuǎn)等能級正好處于THz頻譜范圍內(nèi)，奠定了太赫茲光譜技術(shù)在核酸、蛋白質(zhì)、糖類等生物大分子上應(yīng)用的基礎(chǔ)。但是，目前THz光譜技術(shù)應(yīng)用主要集中在樣品是固態(tài)或是干燥狀態(tài)下的單一種類分子的檢測與分析，無法對含有多種生物大分子且處于液相狀態(tài)下的臨床生物樣本的實(shí)際檢測，其原因在于溶液

2、中水分子對THz波的強(qiáng)烈吸收掩蓋了生物大分子的特征峰。
　　目的：本課題擬利用課題前期核酸擴(kuò)增結(jié)果基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)有的太赫茲時(shí)域光譜系統(tǒng)（THz time-domain spectroscopy，THz－TDS）檢測液相條件下的核酸來初步探索性研究THz波的水敏感性；利用金屬開口諧振環(huán)結(jié)構(gòu)的超材料在干燥狀態(tài)下檢測恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（Isothermal exponential amplification reaction，EXPAR）

3、前后反應(yīng)體系初步探討太赫茲波段超材料應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　方法：
　　1.利用NCBI網(wǎng)站查找目的基因序列，設(shè)計(jì)合成四對常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的引物；查閱文獻(xiàn)設(shè)計(jì)恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的引物和模板，對引物、模板和EXPAR反應(yīng)溫度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化去增加目的DNA片段的產(chǎn)率，對模板序列的寡核苷酸進(jìn)行硫代修飾去抑制EXPAR空白對照（NTC）的較早出現(xiàn)非特異擴(kuò)增的現(xiàn)象。
　　2.使用THz－TDS在液相條件下檢測PCR擴(kuò)增后

4、純化的DNA片段，獲得四種片段DNA水溶液和去離子水的時(shí)域譜和頻域譜；構(gòu)建樣本厚度120μm的檢測池來減弱水敏感度問題。
　　3.設(shè)計(jì)并制作一種金屬開口諧振環(huán)陣列的超材料來提高THz波檢測靈敏度，在充滿氮?dú)飧稍锃h(huán)境下使用THz-TDS系統(tǒng)檢測干燥的核酸以及EXPAR擴(kuò)增前后反應(yīng)體系。
　　結(jié)果：
　　1.常規(guī)PCR的反應(yīng)結(jié)果良好，無需進(jìn)一步對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化探索；恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度為57.6℃，通過對模板序

5、列的硫代修飾明顯減弱了NTC的非特異擴(kuò)增，同時(shí)也導(dǎo)致了它的引物需要量提高了104倍以上。
　　2.設(shè)計(jì)的四對上下游引物成功擴(kuò)增出145bp、202bp、281bp、357bp四種不同長度的DNA片段。THz－TDS系統(tǒng)在液相條件下未能檢測出它們的特征吸收峰，但同一摩爾濃度下它們的吸收強(qiáng)度各有差異且四種不同片段DNA與水吸收系數(shù)差值呈單調(diào)變化，357bp的DNA片段的吸收系數(shù)最小。
　　3.在金屬開口諧振環(huán)結(jié)構(gòu)的超材料上，14

6、5bp長度的DNA片段的靈敏度為118.3ng/GHz；EXPAR擴(kuò)增前反應(yīng)體系的頻率偏移量Δf1=（54±3）GHz、擴(kuò)增后反應(yīng)體系頻率偏移量Δf2=（60±5）GHz。
　　結(jié)論：
　　1.設(shè)計(jì)的檢測池在THz-TDS下檢測并區(qū)分了不同片段長度的DNA，THz-TDS技術(shù)有望成為臨床上一種新的定量檢測手段。
　　2.文中通過對EXPAR模板序列的硫代寡核苷酸的修飾有效的解決了NTC出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象，EXPAR這一高效率