核酸恒溫擴增技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的比較研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種人畜共患傳染病，結(jié)核分枝桿菌是人和動物結(jié)核病的主要病原。人結(jié)核病和動物結(jié)核病是可以相互傳染的，人類的結(jié)核病可以通過呼吸或飛沫傳給人或其他動物，動物結(jié)核病除了通過呼吸或飛沫外，還可以通過一些動物產(chǎn)品如肉、奶、蛋等畜產(chǎn)品進行傳播。目前，最為常見的動物結(jié)核就是牛結(jié)核病，它不僅給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的影響，并且給人類的健康安全也造成了很大的威脅。近年來，人

2、結(jié)核病的發(fā)病率明顯上升，特別是兒童腸結(jié)核的發(fā)病率明顯增加，有報道顯示，從這些兒童患者中分離的30％的菌株為牛分枝桿菌。結(jié)核病的實驗室診斷是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，同時也是確定結(jié)核病診斷、切斷傳播途徑并制定治療方案的重要依據(jù)。由于傳統(tǒng)的檢測方法不夠完善，如檢測時間長、靈敏性與特異性不高、對設(shè)備要求高等。因此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、價格低廉的結(jié)核病實驗室診斷方法對結(jié)核病控制有著極為重要的意義。
　　目的：建立一種快速、準(zhǔn)確、價格低

3、廉易于臨床推廣的，并可以運用于畜產(chǎn)品中結(jié)核分枝桿菌檢測的方法。
　　方法：通過優(yōu)化環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)與 RNA恒溫擴增實時檢測技術(shù)(Simultaneous amplification and testing，SAT)的反應(yīng)條件與體系，建立起兩種可以用于牛乳中結(jié)核分枝桿菌檢測的核酸擴增方法。本實驗通過對牛奶中結(jié)核分枝桿菌的 DNA和 RN

4、A的提取方法以及對每種方法的反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間進行優(yōu)化，并對牛乳中結(jié)核分枝桿菌檢測的靈敏度、特異性、重復(fù)性進行檢測，確定這兩種方法對牛乳中結(jié)核分枝桿菌的最低檢測濃度（靈敏度）。同時還將環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)與RNA恒溫擴增實時檢測技術(shù)同結(jié)核羅氏培養(yǎng)技術(shù)、抗酸染色鏡檢、PCR技術(shù)進行比較，評價與分析各種檢測方法對牛乳中結(jié)核分枝桿菌的檢測結(jié)果，以確定最佳檢測方法，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。
　　結(jié)果：環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)和 RNA恒

5、溫擴增實時檢測技術(shù)的靈敏度、特異性、重復(fù)性都比較高，對牛乳中結(jié)核分枝桿菌的最低檢測濃度分別為3×101 CFU/mL和3×100 CFU/mL。 RNA恒溫擴增實時檢測技術(shù)的靈敏度要明顯高于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)，并且是它的10倍。牛乳中結(jié)核分枝桿菌的 DNA與 RNA的提取方法分別為改良后的 CTAB/NACL法與改良后的手工提取 RNA法。結(jié)核培養(yǎng)技術(shù)、抗酸鏡檢、PCR技術(shù)對牛乳中結(jié)核分枝桿菌的檢測的最低濃度分別為3×105 CFU/m