基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增轉(zhuǎn)基因成分可視化檢測技術(shù)研究.pdf

1、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種快速、靈敏度高、特異性強的等溫核酸擴增技術(shù)，已被廣泛用于各領(lǐng)域。同時，LAMP的高靈敏度也使擴增產(chǎn)物開蓋檢測極易出現(xiàn)污染，而利用閉管檢測技術(shù)能有效降低污染機率。目前， LAMP結(jié)果檢測方法主要有電泳、濁度分析、熒光染料、LFD、微流控等，其中應(yīng)用較多的是電泳、濁度分析、HNB以及SYBR Green I指示劑?，F(xiàn)有方法存在需開蓋

2、、材料昂貴、顏色變化均屬同一色系等不足，為此本實驗進行了三項獨立的研究，主要研究成果如下：
　　(1) LAMP-ACBK檢測系統(tǒng)：本實驗引入一種新型的金屬指示劑-酸性絡(luò)藍 K（Acid Chrome Blue K，ACBK）建立了閉管LAMP結(jié)果可視化檢測技術(shù)。首先，我們在LAMP擴增的起始體系中，分別測試了ACBK與緩沖液、dNTPs、引物、Mg2+等組分的反應(yīng)，確定了含ACBK的LAMP體系其顏色變化由Mg2+決定，化學(xué)方法

3、也進一步驗證了這一結(jié)論。隨后以花椰菜花葉病毒35S啟動子（CAMV35S，35S）為靶基因，建立了35S LAMP-ACBK檢測體系。該體系的檢測靈敏度針對轉(zhuǎn)基因水稻的檢測限為100拷貝，在分別含有50 ng的水稻、大豆、油菜和玉米基因組中能檢測出0.1％的轉(zhuǎn)基因含量。同時，利用不同轉(zhuǎn)化事件及不同轉(zhuǎn)基因作物為材料驗證了其檢測特異性，結(jié)果表明構(gòu)建的35S LAMP-ACBK檢測系統(tǒng)具有很強的檢測特異性。最終，將該檢測體系成功用于對實際玉米

4、樣品轉(zhuǎn)基因成分的檢測，檢測結(jié)果既可以裸眼直接判斷也可以借助紫外可見光譜分析。
　　(2) LAMP-G-四聯(lián)體過氧化物酶檢測系統(tǒng)：以G-四聯(lián)體過氧化物酶實驗所產(chǎn)生的綠色為基礎(chǔ)建立了 LAMP擴增和結(jié)果可視化檢測技術(shù)。首先，在 LAMP擴增體系中分別加入（FIP/BIP，F(xiàn)LP/BLP），（FIP/BIP-G4，F(xiàn)LP/BLP），（FIP/BIP，F(xiàn)LP/BLP-G4），（FIP/BIP-G4， FLP/BLP-G4）四組引物組合，

5、在63°C（12，24，36，48，60）min，85°C2 min擴增條件下擴增，確定了（FIP/BIP，F(xiàn)LP/BLP-G4）為LAMP擴增引物。隨后以含35S的轉(zhuǎn)基因材料模板，建立了35S LAMP-G-四聯(lián)體過氧化物酶檢測系統(tǒng)，且該系統(tǒng)針對轉(zhuǎn)基因水稻的檢測限為32 ng/μL。同時，利用不同轉(zhuǎn)化事件及不同作物的轉(zhuǎn)基因材料驗證了其檢測特異性，結(jié)果表明構(gòu)建的35S LAMP-G-四聯(lián)體過氧化物酶檢測系統(tǒng)具有很強的檢測特異性。

6、　　(3) LAMP-試紙條檢測系統(tǒng)：本研究旨在建立一種基于試紙條的35S或TNOS的LAMP擴增結(jié)果檢測方法，該方法在LAMP擴增結(jié)束后2-3 min內(nèi)即可用肉眼判讀結(jié)果。首先對修飾后的LAMP引物做了可用性檢測，隨后，對試紙條的特異性及靈敏度進行了評價。結(jié)果顯示，評價所用的5種陽性樣品均出現(xiàn)質(zhì)控線與檢測線，電泳呈特異的梯狀條帶，與普通PCR結(jié)果一致。表明該試紙條可用于35S及TNOS LAMP擴增結(jié)果的檢測，且有較高的特異性，兩種試