錦鯉皰疹病毒單交叉引物等溫?cái)U(kuò)增可視化檢測方法的建立.pdf

1、錦鯉皰疹病毒病（Koi herpes virus disease，KHVD）是危害養(yǎng)殖鯉最為嚴(yán)重的病毒性疾病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須申報(bào)的疾病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。KHV具有高度傳染性，毒力強(qiáng)，感染錦鯉、鯉及其普通變種。目前KHV的檢測方法大都需要昂貴的儀器設(shè)備，且操作復(fù)雜，需要專業(yè)技術(shù)人員操作，不能滿足現(xiàn)場快速診斷的要求。因此，目前亟需建立一種操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、結(jié)果判定直觀、成本低廉的現(xiàn)場快速檢測方法，為疾

2、病的防控提供技術(shù)支撐。本論文對(duì)錦鯉皰疹病毒病的國內(nèi)外流行現(xiàn)狀、檢測方法以及交叉引物技術(shù)的原理和應(yīng)用等進(jìn)行了闡述，研究與建立了一種與膠體金標(biāo)記的核酸快速檢測試紙條相結(jié)合的錦鯉皰疹病毒單交叉引物等溫?cái)U(kuò)增的可視化檢測方法。
　　本論文研究的主要內(nèi)容如下：
　　1.引物設(shè)計(jì)及病毒DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建。根據(jù)錦鯉皰疹病毒（Koi herpes virus，KHV）保守的DNA聚合酶（DNA polymerase，Sph）基因，設(shè)計(jì)了一組

3、單交叉擴(kuò)增引物，包括交叉引物2a1s，探針引物2 a（2a-Bio）、3a（3a-FIT），剝離引物4s、5 a。利用錦鯉鰭條組織細(xì)胞系Koi-Fin培養(yǎng)增殖KHV，提取病毒基因組DNA。以4s、5a為引物和KHV基因組DNA為模板擴(kuò)增KHV Sph基因的部分片段，然后將該基因片段克隆連接 pMD?-19T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD?-19T-Sph，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板。
　　2.建立交叉引物等溫?cái)U(kuò)增（cross primi

4、ng amplification，CPA）的基礎(chǔ)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，并對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化，最終建立了KHV單交叉引物等溫?cái)U(kuò)增（single cross priming amplification，SCPA）KHV-SCPA方法。本實(shí)驗(yàn)依次優(yōu)化了引物濃度比例、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Betaine濃度、Bst DNA聚合酶用量以及反應(yīng)溫度和擴(kuò)增時(shí)間。最佳反應(yīng)體系各成分終濃度為：1×ThermoPol? Reaction Buffer，交

5、叉引物2a1s1.0μmol/L，探針引物2a（2a-Bio）、3a（3a-FIT）各0.5μmo l/L，剝離引物4s、5a各0.6μmol/L，Mg2+濃度8.0 mmol/L，dNTPs濃度1.2 mmol/L，Betaine濃度0.7 mol/L，Bst DNA聚合酶用量5.6 U，模板DNA1μL，無核酸酶水補(bǔ)足至25μL。最佳反應(yīng)溫度為63℃，最佳擴(kuò)增時(shí)間為60 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳呈現(xiàn)梯形條帶。
　　3.KHV

6、-SCPA特異性檢測及靈敏度測定。提取錦鯉皰疹病毒KHV、鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）、鰻鱺皰疹病毒（AngHV）、大鯢虹彩病毒（GSIV）、白斑綜合征病毒（WSSV）以及細(xì)菌病原嗜水氣單胞菌（Ah）基因組DN A，進(jìn)行特異性檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，KHV-SCPA檢測方法可特異性檢測出KHV。將常規(guī)PCR的檢測靈敏度與本研究建立的KHV-SCPA檢測靈敏度進(jìn)行比較，結(jié)果表明，KHV-SCPA檢測方法靈敏度較之常規(guī)PCR法高出約1000倍

7、。與膠體金標(biāo)記的核酸快速檢測試紙條相結(jié)合，在3~5min內(nèi)可對(duì)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測。
　　綜上所述，本研究建立的KHV-SCPA檢測方法可在63℃下60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增，特異性地檢測出KHV，靈敏度較之常規(guī)PCR方法高出約1000倍。結(jié)合核酸試紙條檢測技術(shù)，在3~5 min內(nèi)可對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測。KHV-SCPA檢測方法不依賴昂貴的儀器設(shè)備與專業(yè)技術(shù)人員，可應(yīng)用于錦鯉皰疹病毒的現(xiàn)場快速檢測中，為錦鯉皰疹病毒