水產(chǎn)品弧菌的等溫核酸擴增可視化檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、弧菌屬是一類廣泛存在于海水、海產(chǎn)品中的細菌。其中有十幾種是能夠引起人疾病的病原菌，引起最多死亡率的是霍亂弧菌、副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌。海產(chǎn)品或其他食品中的弧菌是通過人攝入或者傷口感染至體內(nèi)引起嘔吐、腹瀉等一系列胃腸道疾病或敗血癥甚至死亡。生食海鮮的文化根深蒂固，卻成為弧菌等病原菌對人體健康不利的通道。隨著生食飲食文化的傳播，由弧菌引起的弧菌病報道也受到了關(guān)注?；【目焖贆z測和控制就成為了傳承飲食文化和維護人們安全健康的一個特別重要的途徑

2、。由于傳統(tǒng)的PCR方法的靈敏度、耗時等問題，受到了自身的限制，所以有越來越多的研究關(guān)注于尋求更加適合即時檢測需求的方法。
　　金納米顆粒是符合量子點的具有良好光學(xué)性質(zhì)一種材料。能夠通過合成不同的尺寸和形狀，來獲得不同的光學(xué)性質(zhì)。在近幾年來，金納米顆粒已經(jīng)被引入生物感應(yīng)器中，解決了實際問題，取得了很大的進展。近十幾年來，等溫核酸擴增的開發(fā)在各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。金納米顆粒在等溫核酸擴增技術(shù)中的作用發(fā)揮勢必會帶了更大的突破。本研究

3、以此為研究主旨，分析了環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)的反應(yīng)體系中各個組分與金納米顆粒之間的關(guān)系，摸索最佳反應(yīng)條件。建立了基于重組酶聚合酶擴增技術(shù)對霍亂弧菌的檢測，并引入了金納米顆粒參與反應(yīng)。構(gòu)建了一套完整系統(tǒng)的方法，實現(xiàn)快速、低成本、靈敏可靠的可視化檢測。為基

4、礎(chǔ)實驗室和檢測平臺提供高效的技術(shù)手段，為食源性致病菌的防控和食品安全監(jiān)測提供了技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下：
　　1、通過與qPCR方法對比，我們報道的RPA方法較為靈敏、快速和可靠，在不依賴昂貴設(shè)備儀器的條件下能夠定量檢測海產(chǎn)品中的霍亂弧菌。這種方法在10分鐘內(nèi)實現(xiàn)的檢出限為5個拷貝，在八個獨立的檢測實驗中具有很高的可重復(fù)性?；趌olB基因，RPA的特異性是霍亂弧菌物種內(nèi)高度保守的。RPA在食品行業(yè)中的可應(yīng)用性通過檢測45個對蝦

5、樣品來驗證?？傊?，RPA方法是靈敏、快速的檢測方法，甚至可以量化海產(chǎn)品中的霍亂弧菌。
　　2、在霍亂弧菌 RPA擴增反應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了一個基于RPA與納米金材料的可視化檢測方法。首先，發(fā)現(xiàn)在RPA反應(yīng)體系中103個拷貝質(zhì)粒標準品DNA在6 min后才擴增出，而AuNPs-RPA反應(yīng)體系中同樣濃度的質(zhì)粒標準品DNA較RPA在5.3 min已有擴增信號，其他濃度下均出現(xiàn)AuNPs-RPA比RPA早起信號。說明金納米材料可以提高 RP

6、A的反應(yīng)速率，使得加速了反應(yīng)啟動。其次，闡述了 RPA中蛋白組分和引物與金納米顆粒之間的相互作用，為穩(wěn)定金納米材料提供一個理論基礎(chǔ)。在擴增完成之后，觀察顏色變化，發(fā)現(xiàn)不同加樣順序和是否進行引物孵育 AuNPs過程會影響顏色的結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果引物先與金納米顆粒孵育，然后加上酶，會使對金的保護力保持在最高水平，這時將不會出現(xiàn)實驗組和對照組的顏色對比。在酶失活后再加金，因酶的構(gòu)象發(fā)生變化，此時再加金進去，體系中大量鹽離子得以讓金團聚；把溶

7、液調(diào)至酶的等電點附近，實驗組和對照組都發(fā)現(xiàn)了沉淀現(xiàn)象；在加酶前讓引物和探針與金孵育過夜，實驗組和對照組均始終保持紅色,結(jié)果顯示體系中的混合酶起到了保護金的作用而且是大分子的酶在空間上起到的保護和較強的吸附作用。為呈現(xiàn)定性可視化結(jié)果，需先加酶后加引物，最終有陽性結(jié)果的顏色為藍色，陰性結(jié)果的顏色為紫紅色。原因是重組酶纏繞引物形成引物-酶聚合物，使得引物和酶都失去了金保護功能。雖然發(fā)生擴增反應(yīng)，雙鏈DNA無法彌補一些保護功能，對照組因沒有擴增

8、使得重組酶和引物一直纏繞或始終處于纏繞釋放的動態(tài)平衡?？傊?，金納米顆粒能夠提高RPA的反應(yīng)速率，并能定性地顯示結(jié)果，對RPA basic試劑盒的用戶而言，縮短了終點分析的時間，降低了實驗成本。所以，本研究可以給使用 RPA基礎(chǔ)試劑盒的研究者提供簡便的終點分析可視化方法。
　　3、基于 SH修飾引物的AuNPs-LAMP體系的研究內(nèi)容包括：首先確定了ssDNA、dsDNA、dNTP、Bst DNA聚合酶對AuNPs的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

9、ssDNA、dsDNA、dNTP能使AuNPs分散系穩(wěn)定，而Bst DNA聚合酶對其有非特異性吸附，而使AuNPs之間因Bst DNA聚合酶而聚集在一起。
　　其次建立的方法中包括較為特別的方式加入金，以提高金的穩(wěn)定性和檢測的方便度。用AuNPs稀釋引物，形成紅色引物，同時讓SH修飾的引物與AuNPs自我組裝，摒棄了繁瑣的錨定步驟。摸索最佳反應(yīng)條件：溫度參數(shù)設(shè)置范圍為61-65℃；時間范圍在30-65 min內(nèi)；選用16 nm直徑

10、AuNPs濃度2.3 nM、11.5 nM、23 nM、46nM。獲得最佳反應(yīng)條件，即63℃55 min，采用AuNPs23 nM。
　　最終將該可視化方法應(yīng)用于檢測副溶血性弧菌，確定了它的最低檢測限，在55 min內(nèi)達到了定性和200 pg以上可半定量的結(jié)果，陽性結(jié)果和陰性結(jié)果可以根據(jù)管內(nèi)產(chǎn)物顏色是否為紅色或者藍色鑒別。
　　4、基于PEG空間位阻劑的未修飾AuNPs參與LAMP比色法檢測，提出了采用 PEG減少金納米顆粒

11、之間的碰撞幾率，增加空間穩(wěn)定性的機理，并用實驗結(jié)果一一進行驗證。摸索PEG濃度從9％至39%，最終發(fā)現(xiàn)最佳濃度為39%。
　　基于兩種原理，PEG-AuNPs和SH引物-AuNPs LAMP兩種方法進行對比，發(fā)現(xiàn)顏色變化正好相反，陽性結(jié)果呈藍色，陰性結(jié)果呈紅色。以副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌為研究對象，加入兩者各自的靶向引物，實現(xiàn)多重檢測， PEG-AuNPs方法也能在63℃條件下55 min內(nèi)100fg以上的半定量檢測，比SH引物-A

12、uNPs較為靈敏。因此，PEG-AuNPs方法可成為半定量可視化檢測手段，雖以弧菌的特異性檢測為目的，但可普及到其他病原體或其他目標物的核酸檢測，為基礎(chǔ)實驗室和檢測平臺提供高效的技術(shù)手段，為食源性致病菌的防控和食品安全監(jiān)測提供了技術(shù)支撐。
　　整體來看，金納米顆粒材料參與的等溫核酸擴增反應(yīng)體系能夠很好地適應(yīng)即時檢測的需求，不受大型儀器的束縛，在可視化檢測中具有良好的應(yīng)用前景。在可視化的同時，還能避免交叉污染、提高反應(yīng)速率或進行多重