雙齒圍沙蠶MPⅡ兩種ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、本研究通過(guò)已構(gòu)建的雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)金屬結(jié)合蛋白MPII重組表達(dá)菌的活化、擴(kuò)大培養(yǎng)、破碎、離心等,獲得原核表達(dá)產(chǎn)物目標(biāo)蛋白MPII,采用His-Bind蛋白純化試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化,利用考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定目的蛋白濃度;采用純化的重組MPII蛋白免疫家兔,獲得高免血清(一抗),并將純化所得蛋白用碳酸鹽包被液(pH9.6)按200、400、800、1600、3200、6400倍稀釋,將硝

2、酸纖維素膜(NC膜)制成6×8棋盤,包被抗原每孔滴加量2μL,待NC膜干燥后用約10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的小牛血清白蛋白(BSA)37℃培養(yǎng)箱中封閉45min,一抗用PBS按200、400、800、1600、3200、6400、12800倍稀釋,PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,進(jìn)行Dot-ELISA檢測(cè);對(duì)間接ELISA檢測(cè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化;采用所建立的方法對(duì)正常雙齒圍沙蠶頭部、體壁組織、消化道和疣足進(jìn)行了分部位的間接ELISA檢測(cè),確定雙齒

3、圍沙蠶MPII靶組織;采用不同濃度Cd(40、80、120mg/L)、Pb(10、15、20mg/L)、Zn(30、60、90mg/L)分別對(duì)正常雙齒圍沙蠶進(jìn)行急性和慢性脅迫實(shí)驗(yàn)(Cd:0.01、0.5、5mg/LPb:0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/LZn:0.5mg/L、1mg/L、5mg/L)用間接 ELISA檢測(cè)方法測(cè)定靶組織中 MPII的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:純化獲得帶有His標(biāo)簽的MPII蛋白分子量大小為32 K

4、Da左右,制備一抗效價(jià)為1:512000;Dot-ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)限為:包被抗原濃度0.03μg/mL,一抗稀釋度1:6400;間接ELISA最佳檢測(cè)條件為:抗原4℃包被過(guò)夜,封閉時(shí)間2h,一抗孵育30min,二抗孵育45min,發(fā)色10min。檢測(cè)靈敏度為包被抗原0.06μg/mL,一抗稀釋度1:3200。最佳結(jié)合效價(jià)為包被抗原濃度0.24μg/mL,一抗稀釋度1:200,當(dāng)抗原的稀釋度為1:400(0.24μg/mL)、一抗稀釋倍

5、數(shù)為1:200時(shí),OD405值為0.654,P/N值最大。在此基礎(chǔ)上,建立了可信度很高的間接ELISA檢測(cè)定量曲線,確定MPII蛋白的限行范圍在300~4800ng之間;雙齒圍沙蠶MPⅡ表達(dá)部位最高為消化道組織,然后依次為頭、體壁和足;急性脅迫實(shí)驗(yàn)中,三種重金屬均可使得沙蠶MPII蛋白表達(dá)增加,反應(yīng)在第2d到3d最明顯,升高水平與重金屬濃度正相關(guān),其中Cd對(duì)脅迫組升高最明顯;慢性脅迫實(shí)驗(yàn)中,三種重金屬也均可使雙齒圍沙蠶MPⅡ出現(xiàn)表達(dá)增加