雙齒圍沙蠶消化道降油細(xì)菌的分離鑒定及菌群多樣性分析.pdf

1、雙齒圍沙蠶(Pernereis aibuhitensis)隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門、多毛綱,是重要的海洋沉積食性無(wú)脊椎動(dòng)物,其遷徙距離短,在我國(guó)河口沉積物和沿海灘涂有著廣泛的地理分布。雙齒圍沙蠶能夠蓄積大量環(huán)境中的有機(jī)污染物并通過(guò)自身的生物轉(zhuǎn)化作用代謝和分解污染物,沙蠶也可以改善養(yǎng)殖水體底質(zhì),減輕和修復(fù)環(huán)境污染,是海洋沉積環(huán)境早期污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的指示生物和生態(tài)毒理學(xué)研究中重要的模式生物。本研究通過(guò)微生物分離培養(yǎng)的方法定向篩選出雙齒圍沙蠶消化道

2、共棲石油降解菌,并通過(guò)DGGE的方法分析了所分離石油降解菌在雙齒圍沙蠶消化道的分布情況及其腸道共棲菌群多樣性。
　　實(shí)驗(yàn)將采自遼寧盤錦地區(qū)的雙齒圍沙蠶置于實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌海水暫養(yǎng)24h后,將提取的沙蠶消化道樣品勻漿后稀釋用平板法涂布于2216E固體平板培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng)24-48小時(shí),根據(jù)不同菌落形態(tài)挑取單菌落進(jìn)行純化,共分離獲得7株不同菌落形態(tài)的菌株,其中3株菌可在以柴油為唯一碳源的平板培養(yǎng)基中生長(zhǎng),編號(hào)分別為SC11-1、SC11-

3、2、SC11-3,同樣條件下SC11-3菌株生長(zhǎng)狀態(tài)最好,作為實(shí)驗(yàn)菌株。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16SrDNA序列比對(duì)的方法對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定并測(cè)定其生長(zhǎng)特性;同時(shí)測(cè)定添加不同葡萄糖濃度該菌株對(duì)柴油的降解性能;為進(jìn)一步揭示以雙齒圍沙蠶為代表的多毛類消化道微生物菌群結(jié)構(gòu)和分布相關(guān)生物學(xué)特征,闡明海洋底棲動(dòng)物對(duì)持久性有機(jī)污染物的生物利用性和耐受性機(jī)理,實(shí)驗(yàn)分別從5條雙齒圍沙蠶消化道提取微生物基因組總DNA,通過(guò)細(xì)菌16S rDNA通用引物

4、341F/534R進(jìn)行了細(xì)菌V3高變異區(qū)的PCR擴(kuò)增,再將 PCR產(chǎn)物(約230bp)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE),從而獲得雙齒圍沙蠶消化道共棲細(xì)菌群落特征的 DGGE條帶;分別對(duì)DGGE圖譜中公共條帶的序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì),分析其消化道的細(xì)菌多樣性特征。結(jié)果顯示:菌株SC11-3經(jīng)過(guò)在25℃振蕩培養(yǎng)(150rpm/min)15天后,對(duì)柴油的原始降解率約為40%;SC11-3菌株為革蘭氏陰性菌、桿狀,生理生化特征與游海假交替單胞菌(Pe

5、udoalteromonas haloplanktis)相符,16SrDNA同源性為100%;SC11-3菌株最適生長(zhǎng)溫度和pH分別為25℃和pH8,適宜NaCl濃度在1-3%之間;添加不同濃度的葡萄糖后,其降解效率有顯著提高,葡萄糖添加量達(dá)到4g/L時(shí),可降解柴油50mg以上,繼續(xù)增加葡萄糖濃度,對(duì)降解率有抑制作用;通過(guò)對(duì)指紋圖譜的半定量分析發(fā)現(xiàn),雙齒圍沙蠶消化道共棲細(xì)菌菌群多樣性豐富,優(yōu)勢(shì)條帶明顯,不同雙齒圍沙蠶個(gè)體間既存在著共同的

6、細(xì)菌種屬,也有各自特異的種屬,DGGE圖譜分析結(jié)果顯示5條沙蠶腸道樣品擴(kuò)增條帶數(shù)分別為22、21、18、18、19,其中樣品間存在共同的優(yōu)勢(shì)條帶,但優(yōu)勢(shì)條帶含量存在個(gè)體間的差異;公共條帶測(cè)序有下列十種細(xì)菌:假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas sp.)未培養(yǎng)假交替單胞菌(Uncultured Pseudoalteromonas sp.),伊麗莎白菌屬(Elizabethkingia sp.),產(chǎn)丙酸菌屬(Unculture

7、d Propionigenium sp.),未培養(yǎng)細(xì)菌(Uncultured bacterium),桿菌屬(Bacterium),未培養(yǎng)假交替單胞(Uncultured Pseudoalteromonas sp.),交替單胞菌科(Alteromonadaceae bacterium),未培養(yǎng)γ-變形菌綱(Unculturedγ- proteobacterium),假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas sp.),其中產(chǎn)丙酸菌