布魯氏菌競爭ELISA檢測方法建立及應用.pdf

1、目的：目前我國尚無基于脂多糖（LPS）抗原的，商業(yè)化的布魯氏菌競爭ELISA（CELISA）試劑盒，用于臨床血清學診斷的CELISA多為國外試劑盒，因成本高，而不利于基層推廣。為此，建立擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的，基于LPS的CELISA試劑盒顯得尤為重要。我們目的是，以LPS為抗原，建立快速、敏感、特異的CELISA免疫診斷試劑盒。
　　方法：采用改良的熱酚水法提取羊種布魯氏菌16M SLPS抗原，并對所提取SLPS抗原活性等進行鑒定，

2、經(jīng)鑒定合格的SLPS抗原，用于單克隆抗體的制備與試劑盒包被抗原。同時，對單抗快速篩選方法進行摸索，經(jīng)過交叉篩選，半固體培養(yǎng)法篩選，篩選能與羊種布魯氏菌16M、牛種布魯氏菌544、豬種布魯氏菌S2反應，而不與大腸桿菌O157、耶爾森菌O9產(chǎn)生交叉反應的單抗。并基于該單抗，建立CELISA試劑盒，對所建立的CELISA試劑盒進行了初步評價，如敏感性、特異性、符合率、重復率等。
　　結(jié)果：⑴經(jīng)改良的熱酚水法提取，得到高純度、高抗原活性的

3、羊種布魯氏菌16M LPS抗原，并對其經(jīng)行標準化實驗，所提取的LPS可用于試劑盒的研發(fā)；⑵經(jīng)過交叉篩選方案，得到了五株高特異性、高親和力的IgG亞類單抗，并選擇效果最優(yōu)的一株，6-7D4進行方法建立；⑶采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)篩選法對單抗進行篩選，提高了得到單抗的幾率，同時又縮短了特異性單抗篩選所需的時間；⑷基于布魯氏菌16M SLPS抗原與抗16M LPS特異性單抗6-7D4，初步建立了CELISA免疫診斷試劑盒；⑸用所建立的CELI