兩種高效的SARS病毒RNA檢測方法的研究.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)是由一種新型冠狀病毒(SARS病毒)引起的急性呼吸系統(tǒng)疾病.本文通過現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)手段,建立了兩種獨特的高效的SARS病毒RNA檢測方法.競爭RT-Nested PCR方法,通過構(gòu)建Internal Control RNA,使其同時具有陽性對照、內(nèi)部對照、競爭性RNA的三重功能,彌補(bǔ)了至今普遍被應(yīng)用的RT-Nested PCR方法檢

2、測SARS病毒RNA易于出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果及不能對SARS病毒RNA進(jìn)行定量分析的不足,大大降低了出現(xiàn)假陽性和假陰性的機(jī)率,同時能對SARS病毒RNA進(jìn)行半定量分析.實時熒光定量one step RT-PCR方法,通過進(jìn)行大量的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的探討實驗,建立了一種快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏的SARS病毒RNA定量檢測體系.快速——時間僅需40多分鐘,目前報道同類方法約需2個小時.準(zhǔn)確——SARS病毒RNA檢測用探針采用FAM標(biāo)記,

3、Internal Control RNA檢測用探針采用ROX標(biāo)記,結(jié)果無需電泳,在同一反應(yīng)體系中兩波段同時實時監(jiān)控,最有效地控制假陽性、假陰性的結(jié)果.同時應(yīng)用構(gòu)建的SARS ControlRNA繪制的標(biāo)準(zhǔn)定量曲線,具有高度信賴的定量線性關(guān)系.特異——采用了Taq Man探針方法和Hot Start用DNA聚合酶Ex Taq HS可進(jìn)行高靈敏度、高特異性地檢測.靈敏——最低可檢測到數(shù)拷貝的體外轉(zhuǎn)錄RNA分子.本研究結(jié)果表明,上述兩種SAR