過表達bldD基因?qū)t色糖多孢菌紅霉素產(chǎn)量及孢子形成的影響.pdf

1、紅霉素（erythromycin）是一類具有廣譜抗菌效果的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由革蘭氏陽性菌紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，也稱糖多孢紅霉菌）產(chǎn)生。紅霉素在臨床上應(yīng)用非常廣泛，所以提高紅霉素產(chǎn)量具有重要意義。紅色糖多孢菌中紅霉素產(chǎn)量受多種因子影響，已發(fā)現(xiàn)多個基因可影響紅霉素的生物合成，2008年在紅霉素高產(chǎn)菌株中發(fā)現(xiàn)bldD基因是紅霉素合成的正調(diào)控基因。正調(diào)控基因在目的鏈霉菌中過量表達可獲得抗生素高產(chǎn)

2、菌株，此種方法已發(fā)展的較為成熟。所以在本研究中我們進一步在紅色糖多孢菌A226中過表達bldD基因，以期獲得紅霉素高產(chǎn)菌株，并探討過表達bldD基因?qū)t色糖多孢菌形態(tài)分化過程的影響。
　　 本實驗首先通過基因工程方法成功構(gòu)建了可在紅色糖多孢菌中表達的整合型質(zhì)粒pZMW-bldD質(zhì)粒。為了檢測該質(zhì)粒在紅色糖多孢菌中的活性，將其在PEG介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入紅色糖多孢菌突變株A226-△bldD中，該突變株是由本實驗室構(gòu)建的紅色糖多孢菌bldD

3、基因突變菌株，其產(chǎn)紅霉素水平明顯降低且喪失產(chǎn)孢能力。通過安普抗性篩選及PCR鑒定獲得一株pZMW-bldD質(zhì)粒在突變株A226-△bldD中轉(zhuǎn)化成功的陽性菌株，即紅色糖多孢菌A226-△bldD/bldD。同時接種A226-△bldD/bldD、A226-△bldD及對照菌株A226到TSB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵120h，運用高效液相色譜分析各菌株發(fā)酵液中紅霉素含量，發(fā)現(xiàn)菌株A226-△bldD/bldD產(chǎn)紅霉素水平可提高到接近正常菌株的產(chǎn)紅

4、霉素水平。同時將上述菌株接種到R3M固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)，比較這幾株菌株的孢子形成情況，發(fā)現(xiàn)在回補菌株A226-△bldD/bldD中孢子形成能力得到恢復(fù)。這表明pZMW-bldD質(zhì)?？稍诩t色糖多孢菌體內(nèi)成功表達，這為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 與上述方法類似本實驗進一步在正常菌株A226中引入質(zhì)粒pZMW-bldD，鑒定并獲得bldD基因過量表達菌株A226/bldD。將菌株A226及A226/bldD同時接種到液

5、體TSB培養(yǎng)基和固體R3M培養(yǎng)基上，比較這兩個菌株的產(chǎn)紅霉素水平及產(chǎn)孢情況的差異，發(fā)現(xiàn)菌株A226/bldD與A226產(chǎn)紅霉素水平相比可提高20％，同時菌株A226/bldD較之A226產(chǎn)白色孢子的時間提前1-2天。
　　 本實驗通過增加紅色糖多孢菌調(diào)控基因bldD的拷貝數(shù)，成功構(gòu)建了紅霉素高產(chǎn)菌株A226/bldD，將該高產(chǎn)菌株運用于實際生產(chǎn)可有助于提高紅霉素產(chǎn)量。同時在本實驗中也發(fā)現(xiàn)bldD的拷貝數(shù)對紅色糖多孢菌產(chǎn)孢時間也有