vgb基因和bldD基因在活躍蓮霉菌中的過(guò)表達(dá)及其對(duì)諾西肽產(chǎn)量的研究.pdf

1、諾西肽(Nosiheptide，Nos)又稱那西肽，是由活躍鏈霉菌（Streptomycesactuosus）產(chǎn)生的一種含硫多肽類(lèi)抗生素，與鹽屋霉素、微球菌素、高硫青霉素、硫鏈絲菌肽及GE2270A等同屬于硫肽類(lèi)抗生素。它主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，最低抑制濃度僅為8ng/mL，對(duì)部分革蘭氏陰性菌及少量病毒也有一定的抑制作用。由于諾西肽具有毒副作用低，抑菌活性高及無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，已被開(kāi)發(fā)為一種新型飼料添加劑，廣泛應(yīng)用于促進(jìn)禽畜的生長(zhǎng)以及疾

2、病的預(yù)防控制等領(lǐng)域，但產(chǎn)量較低一直限制其廣泛應(yīng)用的主要因素，本研究主要通過(guò)表達(dá)外源基因來(lái)提高諾西肽的產(chǎn)量，但是產(chǎn)量較低一直是限制其廣泛應(yīng)用的主要因素，本研究主要通過(guò)表達(dá)外源基因來(lái)提高諾西肽的產(chǎn)量。
　　 血紅蛋白是一種能與O2進(jìn)行可逆性地結(jié)合，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中的球蛋白。Vitreoscillahemoglobin(VHb)是存在于透明顫菌屬的血紅蛋白，當(dāng)O2濃度較低的情況下可以被大量誘導(dǎo)表達(dá)，以滿足貧氧條件下對(duì)氧氣

3、的需求。隨著基因工程的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)表達(dá)VHb的vgb基因不僅能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定存在和表達(dá)，而且還可以在真菌、假單胞菌、鏈霉菌等中成功表達(dá)，能顯著提高α-淀粉酶、放線紫紅素、紅霉素等次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。
　　 bld基因家族是鏈霉菌中的全局性調(diào)控基因，目前已確定其成員包括bldA、bldB、bldC、bldD、bldH及bldK等，其中bldD基因?qū)π螒B(tài)分化及抗生素的形成的調(diào)控作用較為明顯。在天藍(lán)色鏈霉菌中敲除bldD基因后，

4、突變體由于缺少氣生菌絲表現(xiàn)出“光禿”表型，而且所產(chǎn)生的放線菌紫素、十一烷基靈菌紅素、鈣依賴的抗生素都受到了不同程度的抑制;在糖多孢紅霉菌中敲除該基因后，紅霉素的合成能力會(huì)大大下降，且在糖多孢紅霉菌中過(guò)表達(dá)bldD基因可以明顯提高紅霉素的產(chǎn)量。
　　 本研究首先對(duì)S.actuosus的孢子種進(jìn)行稀釋涂板，挑取不同的克隆分別發(fā)酵，利用分光光度計(jì)法測(cè)定其諾西肽的產(chǎn)量，進(jìn)而篩選出良好的出發(fā)菌株。然后利用PEG的介導(dǎo)作用將表達(dá)性載體pZM

5、，pZM-vgb，pZMW和pZMW-vgb分別轉(zhuǎn)化到S.actuosus的原生質(zhì)體中，成功構(gòu)建了S.actuosus/pZM，S.actuosus/pZM-vgb，S.actuosus/pZMW及S.actuosus/pZMW-vgb四種工程菌株。將S.actuosus出發(fā)菌株及相應(yīng)工程菌株同時(shí)接到SFM大斜面上進(jìn)行活化，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性分析及分光光度計(jì)法對(duì)其諾西肽含量進(jìn)行定量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)

6、在S.actuosus中整合型表達(dá)vgb基因可以使諾西肽的產(chǎn)量提高50％。
　　 本研究還首次將鏈霉菌中的全局性調(diào)控基因bldD成功地轉(zhuǎn)化到S.actuosus中，構(gòu)建S.actuosus/pZMW-bldD，利用同樣的檢測(cè)手段對(duì)S.actuosus出發(fā)菌株及S.actuosus/pZMW-bldD菌株中的諾西肽進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)bldD基因可以穩(wěn)定地整合到S.actuosus中，并且發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)bldD基因可以將諾西肽的產(chǎn)量提高68