過表達(dá)SACE-7301提高紅霉素產(chǎn)量的研究.pdf

1、抗生素（antibiotics）是微生物的次級代謝產(chǎn)物，具有抗病原體、抗癌、抗真菌等多種活性，多種合成基因調(diào)節(jié)其合成。抗生素合成相關(guān)的調(diào)控基因的研究可以為理性提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供理論依據(jù)。紅霉素是革蘭氏陽性放線菌糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)產(chǎn)生的，在臨床上有廣泛應(yīng)用的廣譜抗菌活性的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。本文主要關(guān)注一紅霉素合成相關(guān)的調(diào)節(jié)子SACE_7301，正調(diào)控紅霉素產(chǎn)量的研究。生物信息學(xué)預(yù)

2、測SACE_7301是TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，基因大小660bp，蛋白分子量24.97kDa;實驗室已有實驗結(jié)果證明SACE_7301是紅霉素合成相關(guān)的正調(diào)節(jié)子（在糖多孢紅霉菌A226中缺失SACE7301，發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑菌圈相比A226發(fā)酵液的抑菌圈?。?，并表達(dá)獲得了水溶性蛋白。本研究即在原有實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上深入解析其正調(diào)控紅霉素產(chǎn)量的機(jī)理并加以利用來提高紅霉素產(chǎn)量。
　　本文用R5培養(yǎng)基對已構(gòu)建的菌株進(jìn)行了系統(tǒng)的發(fā)酵

3、，然后利用高效液相色譜對這些菌株的紅霉素產(chǎn)量進(jìn)行了定量分析，結(jié)果繪制成紅霉素產(chǎn)量圖，缺失菌株紅霉素產(chǎn)量降低38％，過表達(dá)菌株提高14％;用RT-PCR對SACE_7301過表達(dá)菌株A226/pZMW-7301和空載A226/pZMW內(nèi)eryAI、ermE表達(dá)量進(jìn)行了比較，結(jié)果看出A226/pZMW-7301內(nèi)兩基因表達(dá)量明顯上調(diào)，這兩實驗確認(rèn)了SACE_7301正調(diào)控紅霉素的合成;為了驗證SACE_7301缺失是否影響菌體初級代謝，對A

4、226及SACE7301缺失突變體ΔSACE_7301的生物量進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示SACE7301的缺失對糖多孢紅霉菌生物量影響不大，說明SACE_7301不是通過調(diào)控初級代謝來調(diào)控紅霉素合成;進(jìn)一步研究SACE_7301調(diào)控紅霉素合成的途徑，在糖多孢紅霉菌基因組內(nèi)尋找SACE_7301的下游靶基因，首先考慮紅霉素合成基因簇內(nèi)結(jié)構(gòu)基因eryAI、ermE基因，凝膠阻滯實驗確證SACE_7301可以結(jié)合在eryAI、ermE的啟動區(qū)，表明

5、SACE_7301可直接調(diào)控eryAI、ermE的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響紅霉素的合成。由于SACE7301與eryAI、ermE啟動區(qū)的在結(jié)合力較弱（1mmol/LSACE_7301才出現(xiàn)明顯阻滯條帶），在紅霉素產(chǎn)生菌A226及WB中增加了SACE_7301的拷貝數(shù)進(jìn)而提高了紅霉素產(chǎn)量。首先利用鏈霉菌整合型質(zhì)粒pSET152構(gòu)建了含1-3個SACE_7301拷貝數(shù)的整合型質(zhì)粒，進(jìn)而導(dǎo)入糖多孢紅霉菌A226中，隨著SACE_7301拷貝數(shù)的增加紅霉

6、素產(chǎn)量明顯提高，其中3拷貝提高最多（提高了44％）。其次RT-PCR對此結(jié)果進(jìn)行驗證，其中eryAI、ermE的表達(dá)量隨著SACE_7301拷貝數(shù)的增加也明顯提高;為了證實多拷貝的整合質(zhì)粒在宿主內(nèi)的是否穩(wěn)定存在，在pSET152質(zhì)粒多酶切位點兩端設(shè)計一對引物，以A226/3×73016天發(fā)酵過程中每天取菌液提取的基因組DNA為模板PCR，結(jié)果PCR獲取條帶單一，說明6天的發(fā)酵過程中3拷貝的SACE_7301可以穩(wěn)定存在。最后研究SACE