輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioide)孢子表面蛋白提取、基因克隆表達與功能分析.pdf

1、菌寄生是菌寄生真菌與寄主真菌間的一種寄生方式，是自然界普遍存在的一種真菌與真菌之間的相互作用。輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioide)是一種重要的植物病原真菌和菌寄生中的寄主真菌，菌寄生真菌纖細齒梗孢(Olpitrichum tenellum)是輪枝鐮孢菌上一種菌寄生真菌，能夠與輪枝鐮孢菌相互識別，互作并寄生。有證據顯示，在菌寄生真菌與寄主真菌相互識別過程中，寄主真菌孢子表面蛋白具重要作用，對其進行研究具有重要科學意

2、義。
　　 疏水蛋白(hydrophpbin)是真菌孢子的一種表面蛋白，它由絲狀真菌特異產生的一類分泌型小分子蛋白質，存在于真菌菌絲細胞壁、孢子表面等結構。它含有8個半胱氨酸殘基和一段分辨性的信號肽，能夠自組裝成雙親性界面，在真菌生長發(fā)育過程中起著極為重要生物學作用。
　　 本文首先采用不同的方法(TCA法、SDS煮沸法、蔗糖滲漲法和凍融法)提取輪枝鐮孢菌孢子表面蛋白，SDS-PAGE電泳檢測結果表明，采用三氟乙酸法獲得

3、了約7條蛋白質條帶，其中一條12kDa處蛋白含量較高；采用SDS煮沸法獲得了約4條蛋白質條帶且有約2條帶分子量在12kDa處；蔗糖滲漲法和凍融法分別獲得約14條和6條蛋白質條帶，前者提取出了大于50kDa的蛋白并且比后者多出一條約25kDa的蛋白。這四種方法獲取蛋白質條帶數(shù)量不同，但具有分子量幾乎相同的條帶。通過比較得知，三氟乙酸法和SDS煮沸法提取的孢子表面蛋白分子量較小，蔗糖滲漲法和凍融法提取的孢子表面蛋白除分子量20kDa以下的蛋

4、白外還能夠提取較大分子量的蛋白。
　　 為了獲得輪枝鐮孢菌疏水蛋白基因，根據GenBank中注冊的兩種疏水蛋白基因序列設計引物，通過RT-PCR擴增得到HydⅠ和HydⅡ兩種疏水蛋白基因cDNA，其中HydⅠ和HydⅡcDNA全長分別為381bp和372bp，分別包含一個由127和124個氨基酸組成的開放閱讀框。構建了畢赤酵母重組表達載體pPIC9K/HydⅠ和pPIC9K/HydⅡ，將重組表達質粒pPIC9K/HydⅠ和pPI

5、C9K/HydⅡ轉化畢赤酵母GS115，獲得了轉酵母工程菌株G-HydⅠ和G-HydⅡ并誘導表達和純化。純化HydⅠ蛋白得到一條分子量為11.7kDa的條帶，其理論等電點為6.08，純化HydⅡ蛋白得到一條分子量為11.2kDa的條帶，其理論等電點為7.61。純化后的蛋白與輪枝鐮孢菌和纖細齒梗孢孢子進行互作，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白能夠使孢子凝集，HydⅠ使孢子凝集的最適宜pH值為6.0,孢子凝集最多的時間為15min；HydⅡ使孢子凝集的最適宜

6、pH值為7.0,孢子凝集最多的時間為10min。
　　 在研究了疏水蛋白孢子對輪枝鐮孢菌孢子及纖細齒梗孢孢子的凝聚作用之后，選取了綠色木霉(Trichoderma viride)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)及九州鐮孢菌(Fusarium kyushuense)真菌孢子作為研究對象，進行孢子凝聚實驗。結果顯示疏綿狀嗜熱絲孢菌及九州鐮孢菌孢子與疏水蛋白互作后孢子凝集，而使凝聚的綠色木霉孢子分散