輪枝鐮孢(Fusarium verticillioide)五種疏水蛋白的功能研究.pdf

1、疏水蛋白是由絲狀真菌特異產生的一類分泌型小分子蛋白質，分子量在10kDa左右，疏水蛋白最主要的特點是其肽鏈含有8個半胱氨酸，形成四個鏈內二硫鍵。疏水蛋白能夠在疏水介質的表面自我折疊，改變介質表面的疏水或親水特性，在真菌菌絲的生長發(fā)育，孢子的擴散傳播以及病原真菌致病性上都有重要的功能。先期研究表明部分真菌疏水蛋白具有凝集素性質，而凝集素在分子識別中發(fā)揮著重要作用。本研究選取輪枝鐮孢（Fusarium verticillioide）的五種疏

2、水蛋白基因作為研究對象，研究它們表達產物的凝集活性以及與輪枝鐮孢的寄生性真菌纖細齒梗孢（Olpitrichum tenellum）互作中的功能。
　　 根據(jù)GenBank中注冊的三種疏水蛋白基因序列設計引物，通過RT-PCR擴增得到輪枝鐮孢的三種疏水蛋白基因FvHYD3、FvHYD4及FvHYD5，構建了三種基因及FvHYD3與嗜熱子囊菌光孢變種（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）纖維

3、素酶基因eg1融合基因的重組酵母表達載體，分別命名為pPIC9K/HYD3、pPIC9K/HYD4、pPIC9K/HYD5和pPIC9K/HYD3-eg1，轉化酵母菌株GS115后篩選獲得酵母工程菌株G-HYD3、G-HYD4、G-HYD5、G-HYD3-eg1，將上述工程菌株和含有疏水蛋白基因FvHYD1和FvHYD2的酵母工程菌株G-HydⅠ和G-HydⅡ進行誘導表達，純化后的產物分別命名為Hyrophobin3、Hyrophobi

4、n4、Hyrophobin5、融合蛋白RH及Hyrophobin1、Hyrophobin2，Western-blot驗證表明我們獲得的純化產物為疏水蛋白。
　　 五種疏水蛋白分別對兔血紅細胞、輪枝鐮孢（F.verticillioide）孢子、九州鐮孢菌(Fusarium kyushuense）的孢子以及纖細齒梗孢(O.tenellum)的孢子進行凝集反應，結果表明五種蛋白都具有明顯的凝集活性，但是每種蛋白對不同孢子的凝集活性不同

5、，并且部分糖溶液和金屬離子對疏水蛋白的凝集活性有影響。融合蛋白的研究表明RH能夠吸附于酵母菌體和疏水介質聚氯乙烯表面，表明疏水蛋白具有極強的粘附特性，并且該性質與疏水蛋白的凝集活性密切相關。為了深入研究寄生性真菌纖細齒梗孢對輪枝鐮孢的初始分子識別機制，本實驗將輪枝鐮孢（F.verticillioide）五種疏水蛋白基因進行敲除，采用PEG介導轉化法，經過潮霉素抗性篩選，成功獲得了FvHYD5基因缺失的突變體，但是兩者互作研究沒有表型差異

6、。
　　 選取Hyrophobin3、Hyrophobin4及Hyrophobin5的純化產物與玉米葉片互作，透析液作為對照，研究表明Ⅱ型疏水蛋白Hyrophobin4和Hyrophobin5能夠誘導玉米防御反應酶的表達，Hyrophobin4能夠顯著提高防御反應酶的活性，Hyrophobin5雖能引起防衛(wèi)反應酶活性的提高，但是效果并不顯著。此外，將Hyrophobin4注入玉米髓部組織，結果表明該蛋白能夠顯著提高玉米髓部組織防

7、御反應相關酶的活性，特別是POD酶活性。
　　 通過以上的研究工作，表明了輪枝鐮孢（F.verticillioide）五種疏水蛋白具有凝集活性，輪枝鐮孢Hyrophobin1、Hyrophobin2、Hyrophobin3及Hyrophobin4對其寄生性真菌纖細齒梗孢(O.tenellum)的孢子具有凝集作用，這說明疏水蛋白在兩種真菌的分子識別上發(fā)揮著一定作用，這些研究為菌寄生真菌的初始分子識別機制的研究提供了新的思路。目前Ⅱ