高毒力大麗輪枝菌特異分泌蛋白基因功能研究.pdf

1、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae，VD）的寄主范圍極廣，可以侵染600多種植物，其中主要農(nóng)作物184種，全球每年因其造成的經(jīng)濟(jì)損失超過10億美元。在棉花上引起的棉花黃萎病被稱為棉花的“癌癥”，是我國棉花生產(chǎn)上的第一大病害，嚴(yán)重影響我國棉花的產(chǎn)量。近年來的研究表明大麗輪枝菌胞外分泌蛋白是造成棉花黃萎、落葉和減產(chǎn)的主要因素之一，因此深入研究大麗輪枝菌的胞外分泌蛋白將為制定有效的防治棉花黃萎病提供理論依據(jù)。
　　本實(shí)

2、驗(yàn)室前期通過二代測序技術(shù)對(duì)分離自棉花的高、低兩種致病類型的大麗輪枝菌開展了全基因組測序工作。通過比較基因組學(xué)分析得到了高毒力大麗輪枝菌VDG1相對(duì)于低毒力菌株VDG2的11個(gè)特異大片段。利用SignalP3.0、TMHMM2.0、WoLF PSORT、Phobius和Y-Loc等生物信息學(xué)方法對(duì)特異大片段上編碼的蛋白進(jìn)行了分泌特性預(yù)測，并從中克隆了這11個(gè)特異大片段上6個(gè)特異分泌蛋白的編碼基因;并將這6個(gè)特異的分泌蛋白分別命名為HSSP

3、1(HighVirulent Special Secreted Protein1, HSSP1)、HSSP2、HSSP3、HSSP4、HSSP5和HSSP6。
　　依據(jù)基因組測序信息，設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物，分別通過PCR對(duì)這6個(gè)基因在VDG1中的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證;通過SignalP3.0預(yù)測了其信號(hào)肽的編碼序列，并利用酵母信號(hào)肽跟蹤系統(tǒng)對(duì)預(yù)測的信號(hào)肽序列進(jìn)行了活性驗(yàn)證。結(jié)果表明這6個(gè)信號(hào)肽序列均具有分泌活性，即這6個(gè)蛋白均為有活性的分

4、泌蛋白。在此基礎(chǔ)上對(duì)VDG1在侵染感病寄主軍棉1號(hào)后的不同的侵染時(shí)間點(diǎn)檢測了這6個(gè)基因的表達(dá)情況，檢測表明這6個(gè)基因均在侵染早期被誘導(dǎo)表達(dá)。然后我們利用蔗糖、半乳糖、木糖、木聚糖、淀粉、果膠和纖維素等七個(gè)不同的單一碳源的培養(yǎng)基分析了VDG1中這6個(gè)基因在不同碳源營養(yǎng)條件下的表達(dá)情況，推測這6個(gè)基因可能參與了病原菌的早期侵染過程。
　　為了明確這6個(gè)特異基因與大麗輪枝菌致病力之間的關(guān)系，建立了大麗輪枝菌由PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系

5、，并通過該體系成功獲得了除HSSP以外其它5個(gè)HSSP基因。對(duì)這5個(gè)突變株的生物量（菌絲和孢子產(chǎn)量）進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株與野生型相比均明顯降低，但是突變株之間的生物量降低程度差異較大。對(duì)這5個(gè)突變株利用單一碳源培養(yǎng)基分析了突變體對(duì)測試碳源的利用情況，發(fā)現(xiàn)雖然突變體菌落形態(tài)上并未產(chǎn)生較大變化，但對(duì)碳源的利用上卻產(chǎn)生一定的差別。進(jìn)而利用定量蘸根接種方法對(duì)這5個(gè)突變株進(jìn)行了致病力測定，與野生型高達(dá)65的病情指數(shù)相比突變體的致病能力均有所