沙門氏菌C1血清組特異基因功能分析.pdf

1、沙門氏菌（Salmonella）是一種重要的食源性致病菌，由其引發(fā)的食物中毒病例在世界范圍內(nèi)居首位。依據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的差異，可將該菌分為46個(gè)血清組，2600多個(gè)血清型，能夠感染人類的致病菌株主要集中在A、B、C1、C2和D血清組中，其中，C1血清組包含多個(gè)高致病性的沙門氏菌血清型（如豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌和嬰兒沙門氏菌等）。O7抗原是C1血清組所特有的抗原，但是，對其形成的遺傳途徑卻知之甚少。本課題組前期依托沙門氏菌基因組學(xué)和

2、生物信息學(xué)平臺，采用比較基因組學(xué)的方法挖掘出沙門氏菌C1血清組的7個(gè)特異基因。這些C1血清組特異基因的編碼產(chǎn)物全部為功能未知的蛋白，如：SC2092、SC0368和SC0595，這三個(gè)基因編碼含有多個(gè)跨膜域的膜蛋白。對它們功能的分析將進(jìn)一步揭示 C1血清組特有 O7抗原合成的遺傳途徑，并為闡明血清型與基因型的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　本研究采用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測了沙門氏菌C1血清組特異基因與編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)序列、二級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

3、及其功能；采用同源重組的方法，構(gòu)建了基因缺失突變株，通過評價(jià)突變株在血清凝集、生長狀態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運(yùn)動能力等多個(gè)方面的變化，得到了受到特異基因缺失影響的生物學(xué)通路；再利用RT-qPCR和RNAseq技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平上，探討了受到C1血清組特異基因影響的關(guān)鍵基因與調(diào)控通路，并檢測了差異基因的表達(dá)情況。綜合上述結(jié)果，本研究得到沙門氏菌C1血清組特異基因的功能和/或?qū)1血清組菌株（以豬霍亂沙門氏菌為代表菌株）的生物學(xué)特征的影響。主要研究內(nèi)容

4、和結(jié)果如下：
　　1）生物信息學(xué)方法預(yù)測基因功能從NCBI網(wǎng)站（http://ncbi.nlm.nih.gov/）上，分別下載了C1血清組特異基因SC2092、SC0368和SC0595的核苷酸與對應(yīng)的氨基酸序列，使用Blastn(p)軟件對它們的一級結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行同源比對，再使用TOPCONS軟件對三個(gè)膜蛋白進(jìn)行拓?fù)涠壗Y(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果表明：a)這些基因的核苷酸及其對應(yīng)氨基酸在沙門氏菌C1血清組中具有高度的序列保守性和特異性，僅在屬

5、于C1血清組的菌株中存在，而在其它的沙門氏菌血清組或其它非沙門氏菌菌株中不存在；b)特異基因SC2092，位于O抗原基因簇上，編碼具有12個(gè)跨膜域的膜蛋白（O抗原翻轉(zhuǎn)酶Wzx的重要特征之一），與鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌的wzx/Wzx相比，雖然序列的同源性極低，僅分別為0.8％/23%和4%/24%，但拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)卻高度相似（O抗原翻轉(zhuǎn)酶Wzx的另一重要特征），體現(xiàn)在：在TOPCONS軟件的預(yù)測結(jié)果中，采用不同的算法預(yù)測三個(gè)Wzx蛋白的N端

6、和C端均在細(xì)胞質(zhì)側(cè)，而使用同一算法時(shí)，它們的跨膜域數(shù)目和間隔環(huán)有著幾乎完全相同的結(jié)果；c)特異基因SC0368和SC0595，位于O抗原基因簇外，編碼含10個(gè)跨膜域的膜蛋白，它們的序列具有高度的同源性，核苷酸的同源性為87%，氨基酸的同源性為83%，并且具有幾乎完全一致的二級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
　　2）同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建與缺失突變株的篩選依據(jù)巢式 PCR的原理設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增獲得同源臂片段；通過電轉(zhuǎn)化的方法，在2500 V

7、，5 ms的條件下，將同源臂片段連接于高效蔗糖自殺質(zhì)粒pRE112，成功獲得同源重組質(zhì)粒pRE△wzxC1，pRE△0368與pRE△0595；采用兩步同源重組法（共結(jié)合和蔗糖篩選），以野生型為親本菌，獲得無標(biāo)記缺失突變株△wzxC1、△0368和△0595，以△0368突變株為親本菌，獲得無標(biāo)記雙突變株△0368△0595。突變株的獲得為后期生物學(xué)特征的比較和高通量RNA測序（RNAseq）提供了實(shí)驗(yàn)材料。
　　3）C1血清組特

8、異基因與表面抗原的相關(guān)性分析采用血清玻片凝集和脂多糖（LPS）SDS-PAGE電泳檢測相結(jié)合的方法，來分析缺失突變株菌體表面抗原的變化情況。結(jié)果顯示：a)特異基因SC2092缺失突變株不能形成完整的LPS（O抗原區(qū)域全部缺失），該突變株與O7抗血清的凝集反應(yīng)表現(xiàn)為陰性，抗原的變化結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果相符，因此，該基因在本課題中被命名為 wzxC1；b)特異基因SC0368和SC0595的缺失突變株（△0368、△0595和△0368

9、△0595）與O7抗血清的凝集反應(yīng)均表現(xiàn)為陽性，并且，與野生型相比，在三個(gè)突變株的LPS凝膠電泳圖上未發(fā)現(xiàn)顯著的可見差異，表明這兩個(gè)基因的缺失都未導(dǎo)致 O7抗原合成受阻，然而，基因SC0368的缺失（突變株△0368和△0368△0595）卻影響了HC抗原的合成，即與HC抗血清的凝集反應(yīng)表現(xiàn)為陰性。
　　4）C1血清組特異基因缺失突變株的表型特征檢測 a)沙門氏菌C1血清組特異基因SC2092（wzxC1）的缺失，使細(xì)菌缺乏在固體

10、培養(yǎng)基表面的蠕動能力和半固體瓊脂中的游動能力，電子顯微鏡檢測和RT-qPCR的分析結(jié)果表明，自凝聚能力的增強(qiáng)和鞭毛合成相關(guān)基因表達(dá)量的下降是導(dǎo)致運(yùn)動缺陷的主要原因。另外，wzxC1突變株對NaCl更加敏感，一旦在培養(yǎng)基中添加1%的NaCl，突變株細(xì)胞即呈現(xiàn)自凝聚現(xiàn)象，但是在無NaCl添加的培養(yǎng)基中，突變株△wzxC1的運(yùn)動缺陷、自凝聚和鞭毛合成相關(guān)基因表達(dá)量下降現(xiàn)象都會得到恢復(fù)。因此，本研究提出了“wzxC1缺失引發(fā)NaCl依賴型運(yùn)動缺

11、陷”的新理論；b)沙門氏菌C1血清組特異基因SC0368的缺失，導(dǎo)致細(xì)菌生長速度的提高，但是運(yùn)動能力卻喪失。在細(xì)菌生長的穩(wěn)定期，突變株△0368和△0368△0595的生長量（ca.1010 CFU/mL）比野生型和△0595（ca.108 CFU/mL）的生長量高2個(gè)數(shù)量級；鞭毛銀染、電鏡檢測和運(yùn)動性（蠕動與游動）分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明，在基因SC0368缺失突變株（△0368和△0368△0595）中，鞭毛不能合成，細(xì)菌不能運(yùn)動； c

12、)沙門氏菌C1血清組特異基因SC0595的缺失，未發(fā)現(xiàn)對細(xì)菌的生物學(xué)特征有明顯影響。
　　5）RNAseq與 RT-qPCR方法分析差異表達(dá)基因?yàn)榱烁娴牧私?C1血清組特異基因SC0368與 SC0595對細(xì)菌的影響和兩個(gè)基因之間的關(guān)系，本研究利用高通量的RNAseq技術(shù)分析了△0368、△0595與△0368△0595突變株與野生型菌株相比的表達(dá)差異基因，并采用RT-qPCR方法對關(guān)鍵基因進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明：a) C1血清

13、組特異基因SC0368和SC0595在LPS的合成過程中具有協(xié)同作用，只有它們同時(shí)缺失（△0368△0595 vs.野生型）才會導(dǎo)致與LPS核心合成相關(guān)的6個(gè)基因表達(dá)量的顯著下調(diào)；b)在突變株△0368和△0368△0595中，與鞭毛合成以及與細(xì)菌趨化能力相關(guān)的兩條通路中20個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)大幅度下調(diào)，這些基因?qū)儆诒廾铣杉壜?lián)效應(yīng)的第三組（class3），而fliA基因（編碼σ28轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）是第三組的首要啟動基因，它極有可能是首先受

14、到SC0368基因影響的關(guān)鍵因子。
　　綜上所述，本研究從生物信息學(xué)預(yù)測，缺失突變株表型驗(yàn)證及其轉(zhuǎn)錄水平（RNAseq與RT-qPCR）對比分析三個(gè)角度，逐層探討了沙門氏菌C1血清組特異基因SC2092、SC0368和SC0595的功能及其對C1血清組代表菌株（豬霍亂沙門氏菌）生物學(xué)特征的影響。本研究將沙門氏菌血清組特異基因與O抗原/LPS的合成建立了聯(lián)系，為揭示血清型與基因型的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。特異基因缺失突變株的表型變化結(jié)果