利用基因沉默驗(yàn)證大麗輪枝菌糖代謝相關(guān)基因的致病力.pdf

1、大麗輪枝菌是一種土傳性維管束病原真菌，影響多種經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，是棉花黃萎病的病原真菌。由于大麗輪枝菌具有穩(wěn)定存在的微菌核結(jié)構(gòu)以及多變的生理小種，所以其引起的棉花黃萎病至今難以防治。大麗輪枝菌全基因組序列信息的公開為研究大麗輪枝菌致病相關(guān)的關(guān)鍵基因提供了必要的數(shù)據(jù)支持，這也為在分子水平和細(xì)胞水平更好的理解大麗輪枝菌與宿主植物的互作機(jī)制及致病機(jī)理提供了可能性。
　　本實(shí)驗(yàn)室對(duì)已有的大麗輪枝菌數(shù)據(jù)庫提供的VdLs17全基因組序列進(jìn)

2、行初步的生物信息學(xué)分析，根據(jù)基因功能進(jìn)一步劃分為:毒素蛋白相關(guān)、糖代謝相關(guān)和能量代謝相關(guān)等不同種類的基因，構(gòu)建了90多個(gè)VIGS載體，并利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默(HIGS)技術(shù)進(jìn)行初步的表型篩選，獲得約20個(gè)表型良好的基因。本研究利用HIGS技術(shù)篩選和驗(yàn)證了大麗輪枝菌糖代謝相關(guān)的5個(gè)基因VdEG1（外切葡聚糖酶，基因庫編號(hào)VDAG_02898.1）、VdENG1(內(nèi)切葡糖酶，基因庫編號(hào)VDAG_10495.1)、VdMAN1（甘露聚糖內(nèi)-

3、1，6-β-甘露糖苷酶，基因庫編號(hào)VDAG_07477.1）、VdPDF1（多糖脫乙?；易宓鞍?，基因庫編號(hào)VDAG_07727.1）和VdPD1（豌豆素脫甲基酶，基因庫編號(hào)VDAG_05456.1）的功能。考慮到基因功能疊加效果，利用HIGS技術(shù)驗(yàn)證上述糖代謝相關(guān)的單個(gè)基因或多個(gè)基因片段，以及編碼半纖維素酶類三個(gè)基因不同組合的融合基因片段對(duì)大麗輪枝菌致病力的影響。結(jié)果表明，上述HIGS處理的轉(zhuǎn)基因煙草病情指數(shù)、大麗輪枝菌生物量、靶基因

4、表達(dá)量都有所降低，其中VdEG1、VdPDF1的干擾效果最顯著，其次是VdMAN1和VdPD1，混合基因比單基因的干擾效果明顯;此外，3個(gè)纖維素酶類編碼基因（VdEG1、VdMAN1、VdENG1）的融合片段注射實(shí)驗(yàn)表明:其干擾效果要比單基因注射的干擾效果顯著。
　　針對(duì)大麗輪枝菌糖代謝相關(guān)基因VdEG1、VdMAN1、VdPD1和VdPDF1構(gòu)建基因敲除載體并轉(zhuǎn)化Vd991，最終得到vdeg11、vdeg13、vdeg14、vd

5、eg21、vdman6、vdman7、vdman9、vdman12、vdpd2、vdpd10、vdpdf9、vdpdf12這12個(gè)突變株。通過檢測(cè)突變株生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、對(duì)不同碳源利用情況以及致病力，發(fā)現(xiàn)它們的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量都有所降低。vdeg在纖維素、半乳糖、木糖、蔗糖、果膠為唯一碳源的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)速率顯著降低，VdEG1在葡萄糖、木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中高表達(dá)，在葡萄糖、半乳糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露糖的碳源營(yíng)養(yǎng)下與致病因子EP