柑橘大實蠅蛹期發(fā)育的基因表達譜分析及海藻糖代謝相關基因的研究.pdf

1、柑橘大實蠅Bactrocera(Tetradacus) minax(Enderlein)是柑橘類水果的重要害蟲之一，屬雙翅目、實蠅科、果實蠅屬。滯育是昆蟲特定發(fā)育時期發(fā)育停滯，新陳代謝降低以抵御周期性的高溫、低溫、干旱和食物缺乏等不良環(huán)境的一種生理現(xiàn)象，以此來保證昆蟲種群和個體的生存。海藻糖作為昆蟲的血糖，在昆蟲生長發(fā)育和滯育方面起著重要作用。本研究通過對柑橘大實蠅海藻糖合成酶（TPS）、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）和海藻糖酶（Tr

2、e）的分子特性和功能展開了深入的研究，旨在為進一步弄清柑橘大實蠅滯育分子機制提供理論依據(jù)。主要研究結果如下：
　　1.柑橘大實蠅呼吸速率的測定
　　對柑橘大實蠅整個蛹期的呼吸速率進行測定，獲得了柑橘大實蠅蛹期呼吸速率曲線，直接證明了柑橘大實蠅蛹滯育的發(fā)生。根據(jù)呼吸速率曲線把柑橘大實蠅蛹期劃分為五個時期，即滯育準備期（PreD）、滯育早（ED）、中（MD）、后（LD）期以及滯育結束后發(fā)育期（PD）。此外，對20E注射蛹的呼吸速

3、率進行測定，結果顯示20E可以打破柑橘大實蠅蛹的滯育。
　　2.柑橘大實蠅不同滯育期基因表達譜分析
　　利用高通量測序技術對滯育準備期（PreD）、滯育早（ED）、中（MD）、后（LD）期以及滯育結束后發(fā)育期（PD）等五個點收集的柑橘大實蠅蛹進行表達譜測序。在十對兩兩比對的表達譜中，總共有4,808條基因顯著上調或下調，這些基因主要與新陳代謝、信號轉導、內分泌系統(tǒng)和消化系統(tǒng)有關。利用qPCR技術對表達譜的準確性進行了驗證，結

4、果表明隨機挑選基因的qPCR檢測結果與柑橘大實蠅數(shù)字基因表達譜測序結果呈現(xiàn)高度的相關性（皮爾遜相關系數(shù)=0.9534），說明柑橘大實蠅不同蛹期數(shù)字基因表達譜測序結果可信。此外，處于滯育維持期的滯育早（ED）、中（MD）、后（LD）期的樣本在兩兩比較的表達譜中變化差異不大。
　　3.柑橘大實蠅海藻糖代謝相關基因克隆及序列分析
　　克隆獲得了柑橘大實蠅5條海藻糖代謝相關酶基因cDNA全長序列，分別命名為BmTPS、BmTPPB、

5、BmTPPC-1、BmTPPC-2和 BmTre-1。BmTPS開放閱讀框2,445 bp，編碼814個氨基酸殘基。BmTPPB、BmTPPC-1、BmTPPC-2的cDNA開放閱讀框分別為825 bp、822 bp、822 bp，分別編碼274、273、273個氨基酸。BmTre-1的cDNA序列開放閱讀框為1,665 bp，編碼554個氨基酸。預測BmTPS、BmTPPB、BmTPPC-1、BmTPPC-2和BmTre-1蛋白質分子

6、量分別為92.05 kDa、31.27 kDa、30.42 kDa、30.85 kDa和63.78 kDa，等電點分別為6.05、7.10、5.63、5.24和5.15。使用鄰位相連法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，BmTPS基因與所有雙翅目昆蟲TPS聚為一類，BmTre-1聚入 Tre-1類別。
　　4.柑橘大實蠅海藻糖代謝相關基因表達模式、酶活力及糖含量分析
　　利用RT-qPCR技術對柑橘大實蠅海藻糖代謝相關基因在不同發(fā)育階段的的表達

7、模式進行了解析。BmTPS和BmTre-1的表達模式呈相反的趨勢，BmTre-1在整個蛹期表達量較低，而BmTPS在整個蛹期表達量較高。此外BmTPPB、BmTPPC-1和BmTPPC-2基因三者之間的表達模式有細微的差別。
　　對海藻糖合成酶（TPS）、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）和海藻糖酶（Tre）這三種海藻糖代謝相關酶在整個蛹期階段的酶活力進行檢測。結果顯示，海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）呈現(xiàn)出

8、相同的趨勢，第60-120天的階段維持高峰，而Tre酶活力卻在60-120天時下降到最低。
　　對柑橘大實蠅整個發(fā)育階段海藻糖和葡萄糖含量進行了測定。結果顯示，在柑橘大實蠅整個蛹期，其海藻糖含量都維持較高的水平，且波動不大。而葡萄糖含量則是從幼蟲開始至整個蛹期均較低。
　　對柑橘大實蠅1日蛹注射20E后，海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）在化蛹第30天時相較于對照組酶活力顯著上升，而海藻糖酶（Tre）在

9、化蛹第30天和第60天時酶活力相較于對照組則顯著下降。此外注射20E后，海藻糖含量和葡萄糖含量在30日蛹時均顯著下降。
　　5.柑橘大實蠅RNA干擾技術的初步探究
　　為了建立柑橘大實蠅RNA干擾體系，本研究將dsBmTPS注射到柑橘大實蠅三齡幼蟲。結果表明，注射2.0或2.5μg dsBmTPS導致很高的沉默效率，其中注射2.0μg dsBmTPS作用效果最好，可以持續(xù)干擾72 h。BmTPS基因的成功干擾也導致了 BmT