大麗輪枝菌拮抗細菌DM-54菌株的分離及抗菌蛋白純化.pdf

1、棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）侵染引起的真菌性維管束系統(tǒng)病害，是棉花最嚴重的病害之一，給我國棉花生產造成嚴重損失，被稱為“棉花的癌癥”。目前以菌治菌的生物防治被認為是一種最具有發(fā)展?jié)摿Φ挠行Х乐畏椒ā?br>　　 本研究從棉花根際土壤中分離到的891株細菌菌株中篩選出對大麗輪枝菌的生長有抑制作用的89株，其中10株拮抗菌株的無菌體發(fā)酵液表現拮抗活性，說明10株拮抗菌株主要是通過產生抗生類物質來抑制

2、大麗輪枝菌的生長，其中DM-54菌株的活性最高。經進一步分析發(fā)現 DM-54菌株所分泌的抗生類物質屬于蛋白質類。DM-54菌株發(fā)酵液分別對12種病原菌進行抑菌實驗，結果表明對其中大麗輪枝（Verticillium dahliae Kleb），膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz），串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme Sheld），劍蘭炭疽（Glomerella cingul

3、ata）等8種病原菌有較高的拮抗活性，屬較廣抗菌譜的細菌，生防應用前景廣闊。
　　 通過結合形態(tài)特征、生理生化反應及16S rDNA基因序列分析確定DM-54菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
　　 對解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens DM-54菌株產抗菌物質的液態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定DM-54菌株發(fā)酵產抗菌蛋白最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：糊精5％，大豆蛋白胨3％

4、，MgSO40.02％，CaCl20.01％，初始pH7.0；250 mL三角瓶裝液量30 mL，種齡16h，接種量10％，搖床轉速200 r/min，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時間48 h。優(yōu)化前后蛋白抑菌活性差別明顯，優(yōu)化之前抑菌圈直徑16.3 mm，優(yōu)化后22.8 mm。
　　 芽孢是微生物菌劑的最佳制劑形式，對惡劣的環(huán)境因素的具有抗性，可延長制劑保存期，穩(wěn)定活性。對B.amyloliquefaciens DM-54菌株產芽孢條

5、件進一步進行摸索，產芽孢最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：乳糖0.5％、黃豆餅粉2.0％、MnSO4·H2O0.3％、培養(yǎng)液初始pH值為7.5；種齡18 h、裝液量50 mL/250 mL、接種量10％、發(fā)酵時間36 h、溫度為30℃、轉速為220 r/min。在此優(yōu)化條件下，DM-54菌株發(fā)酵液中的菌體芽孢形成率大大提高，最終生物量達到2×109個/mL，芽孢形成率達到98.3％。
　　 通過盆栽實驗，考察棉花黃萎病拮抗細菌DM-54菌株在土

6、壤中的定殖情況及在棉花根內的定殖情況。本實驗分別對滅菌土和非滅菌土這兩種土樣進行拮抗菌的浸種、全部混土和部分混土三種不同處理進行盆栽實驗。結果表明，30d后拮抗細菌DM-54菌株能夠在滅菌土和非滅菌中定殖，定殖數量達106 cfu/g土左右，經過30 d后并保持較高的抑菌活性，并且菌株在滅菌土中的定殖數量高于非滅菌土中的數量。施用方法中以其中全部混土情況下定殖能力最強。通過對棉苗根內細菌的回收，證實拮抗細菌DM-54能在棉花根內定殖，定