大麗輪枝菌拮抗細菌RS-25菌株的分離鑒定、發(fā)酵及抗菌多肽的純化.pdf

1、由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的黃萎病是棉花的主要病害，嚴重影響棉花的生產(chǎn)，目前生物防治被認為是一種最具有發(fā)展?jié)摿Φ挠行Х乐畏椒ā?RS-25 菌株是從棉花根際土壤中分離到的一株產(chǎn)抗菌蛋白對大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)有拮抗活性并具有較廣抗菌譜的細菌。它所分泌的抗菌蛋白對立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysp

2、orum)、串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)、茁芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)等都具有較高的拮抗活性。 通過生理生化反應(yīng)及16S rDNA基因序列分析對RS-25菌株進行了鑒定。生理生化反應(yīng)顯示RS-25菌株大部分特征與解淀粉芽孢桿菌相似。將16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站中進行同源性比較，利用Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示RS-25菌株的16S r

3、DNA序列和數(shù)據(jù)庫中的AB325583菌株解淀粉芽孢桿菌的序列同源性達到99.62％。所以，結(jié)合生理生化反應(yīng)及16S rDNA基因序列分析確定RS-25菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。 為了提高 B.amyloliquefaciens RS-25菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白量，對B.amyloliquefaciens RS-25菌株發(fā)酵培養(yǎng)基所需的碳源、氮源、無機鹽進行了篩選，并采用正交試驗法

4、，對培養(yǎng)基的組成以及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，最終確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基為:蔗糖2.0％，胰蛋白胨1.0％，KH2PO40.20％，CaCl2.2H2O 0.005％，MgS04.7H200.005％。最適發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基初始pH 7.5，接種量4％，種齡10 h，培養(yǎng)基裝液量30 mL/250 mL，于28℃，180 r-min-1搖床振蕩培養(yǎng)48 h。經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化抑菌圈直徑增加了25.4％。 B.amyloliquefaciens

5、RS-25菌株分泌的抗菌蛋白經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和反相層析后，分離純化到單一抗菌多肽A2，經(jīng)SDS-PAGE檢測分子量約為9 kDa?？咕嚯腁2對熱穩(wěn)定；對蛋白酶不敏感；pH活性范圍較寬，在pH 6～8范圍內(nèi)抑菌活性最強，在堿性條件下穩(wěn)定，在強酸性條件下抑菌活性消失。抗菌多肽A2含有糖基，含糖量為1.81％。 經(jīng)EDMAN降解法對抗菌多肽A2的N端15個氨基酸殘基序列進行測定，結(jié)果顯

6、示為H2N-Ala-Ser-Gly-Gly-Thr-Val-Gly-Ile-Tyr-Gly-Ala-Asn-Met-Arg-Ser。以此為靶序列在NCBI網(wǎng)站中用BlastP程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行了類似性檢索，發(fā)現(xiàn)其與來源于Bacillus amyloliquefaciens FZB42所報道的蛋白質(zhì)序列的42～56位置的氨基酸殘基序列100％同源?？咕嚯腁2的部分序列測定為抗菌蛋白基因克隆奠定了基礎(chǔ)同時為棉花黃萎病抗病基因工程提