溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)“針狀樣”毒力裝置相關(guān)基因功能的研究.pdf

1、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）Ⅲ型分泌系統(tǒng)的“針狀樣”毒力裝置(Needle-likeinjectisome)又稱為注射小體，是Ⅲ型分泌系統(tǒng)中一個(gè)復(fù)雜的微型裝置，負(fù)責(zé)將效應(yīng)蛋白傳輸?shù)秸婧思?xì)胞。注射裝置從細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)向外伸出內(nèi)中空的針到達(dá)宿主細(xì)胞表面，該注射過程一共橫跨三層膜。本研究成功克隆并分析了注射裝置上兩個(gè)重要因子:vscP基因和vscX基因。vscP基因ORF為1206 bp，共編碼401個(gè)氨基酸殘基，分子

2、質(zhì)量約為44.4 kD，等電點(diǎn)為5.72。構(gòu)建VscP亞基三維結(jié)構(gòu)模型發(fā)現(xiàn)，其與鞭毛FilK蛋白有相似構(gòu)型。vscX基因ORF為378bp，共編碼125個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量約為14.2 kD，等電點(diǎn)為5.75。網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果顯示vscX與vscY、 vopB、sycN等有相鄰的關(guān)系。VscP和VscX各自具有一個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，分別是T3S4(369-389aa)結(jié)構(gòu)域和Pfam(1-125aa)結(jié)構(gòu)域。
　　運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PC

3、R技術(shù)，結(jié)合2-△△Ct法分析VscP和VscX在分別在溶藻弧菌野生株HY9901、Ⅲ型分泌系統(tǒng)護(hù)航蛋白缺失株△vscO和互補(bǔ)株C-vscO菌株中不同生長時(shí)期的mRNA表達(dá)差異。結(jié)果顯示，VscP和VscX的mRNA表達(dá)量均隨溶藻弧菌HY9901生長而增長，在生長平緩期顯著上調(diào)(p＜0.01)。在vscO基因缺失后，VscP和VscX的mRNA表達(dá)量均在生長晚期顯著上調(diào)(p＜0.01)，說明vscO的缺失破壞了VscO與VscP、Vsc

4、X之間的協(xié)同關(guān)系，使得VscP和VscX在生長晚期表達(dá)過剩。
　　選取VscP抗原制備亞單位疫苗，首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-vscP，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá);然后以28℃，0.4 mM IPTG，5h的最優(yōu)條件培養(yǎng)獲得重組蛋白，并用GST標(biāo)簽的純化柱純化;最后，VscP抗原免疫多鱗鱚(Sillago sihama Forskál)，溶藻弧菌、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）攻毒兩周后，VscP抗原對(duì)多鱗鱚的相對(duì)免疫保護(hù)率

5、分別為67.7％、86.6％，說明VscP抗原有望成為制備具有交叉保護(hù)作用的亞單位疫苗的良好材料。
　　首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究VscP蛋白免疫多鱗鱚后其脾臟蛋白的表達(dá)差異，應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)蛋白進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明，VscP蛋白免疫組所得蛋白點(diǎn)為1316個(gè)，免疫前對(duì)照組所得蛋白點(diǎn)為1149個(gè)， PBS對(duì)照組所得蛋白點(diǎn)為1291個(gè)，PBS+佐劑對(duì)照組所得蛋白點(diǎn)為1316個(gè)。與對(duì)照組相比，在免疫組發(fā)現(xiàn)9個(gè)差異蛋