一種新的鰻弧菌毒力相關(guān)因子MltD的功能研究.pdf

1、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是一種革蘭氏陰性的嗜鹽細(xì)菌，是世界范圍內(nèi)引起弧菌病的重要病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在前期研究中，利用抑制性消減雜交技術(shù)建立了鰻弧菌毒力相關(guān)基因文庫(kù)，并獲得了一個(gè)255 bp的基因片段。為了探索此基因的生物學(xué)功能，在本研究中，應(yīng)用LAPCR技術(shù)獲得了此基因的序列全長(zhǎng)。經(jīng)過序列分析和同源比對(duì)，確定該基因可能編碼一種膜綁定的具有溶解細(xì)胞壁功能的糖基轉(zhuǎn)移酶MltD。生物信息學(xué)分析表明

2、，鰻弧菌的MltD蛋白由523個(gè)氨基酸組成，其功能區(qū)包括N端的信號(hào)肽區(qū)域、一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域SLT和C端的3個(gè)溶解酶結(jié)構(gòu)域LysM，與大腸桿菌(Escherichiacoli)的MltD蛋白結(jié)構(gòu)比較相似，但是大腸桿菌的MltD蛋白由452個(gè)氨基酸組成，并且在C端只有2個(gè)溶菌酶結(jié)構(gòu)域。據(jù)推測(cè)，鰻弧菌MltD蛋白的物理性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，為親水性蛋白；其N端具有一段脂蛋白信號(hào)肽，信號(hào)肽外的其他部分為非細(xì)胞質(zhì)蛋白；整個(gè)分子具有較強(qiáng)的抗原性，二級(jí)結(jié)

3、構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，與其它弧菌中預(yù)測(cè)的MltD蛋白有較高的序列相似性。推斷該蛋白為一種外周膜脂蛋白，在弧菌內(nèi)相對(duì)保守，抗原性強(qiáng)，可以作為抗弧菌病疫苗開發(fā)。
　　 應(yīng)用表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)和表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)建立了mltD基因過量表達(dá)體系--大腸桿菌BL21(DE3)/pET-32a(+)/mltD。表達(dá)的MltD融合蛋白經(jīng)尿素變性，通過鎳-瓊脂糖親和柱純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)證實(shí)，純化的融

4、合蛋白為單一條帶，分子量約為70.2 kDa，與理論值相符。分別測(cè)定了純化的MltD融合蛋白和經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)/pET-32a(+)/mltD的粗酶液的溶血活性、磷脂酶活性、明膠酶活性和淀粉酶活性，結(jié)果顯示，純化的MltD融合蛋白和經(jīng)過誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)/pET-32a(+)/mltD的粗酶液都具有以上的酶活性，而作為對(duì)照的透析液和經(jīng)過誘導(dǎo)的攜帶空載體的大腸桿菌BL21(DE3)/pET-32a

5、(+)的粗酶液都不具上述活性。
　　 依據(jù)同源重組原理成功構(gòu)建了鰻弧菌CW-1的mltD基因突變株。對(duì)野生株和突變株進(jìn)行性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)：在胞外酶實(shí)驗(yàn)中，與野生株相比，突變株的明膠酶活性和胞外水解酶活性都顯著降低，并且完全喪失了溶血活性；在抗高滲透壓實(shí)驗(yàn)中，突變株的抗高鹽高滲能力明顯增強(qiáng)；而在偏酸或偏堿的環(huán)境中，突變株的適應(yīng)能力降低；API20E的結(jié)果顯示，突變株失去了野生株原有的對(duì)葡萄糖的利用能力；而藥敏實(shí)驗(yàn)中，突變株對(duì)菌必治、達(dá)

6、復(fù)欣、先鋒必素、慶大霉素、卡那霉素和羧芐青霉素的敏感性顯著降低，抗性增強(qiáng)。最為重要的是，在毒力研究中發(fā)現(xiàn)，突變株對(duì)腹腔注射感染的斑馬魚的半數(shù)致死量明顯低于野生株，分別為1.01×102 CFU/尾和3.92×103CFU/尾；而對(duì)牙鲆鰓細(xì)胞的侵染速度，突變株也明顯快于野生株，侵染1.5小時(shí)觀察結(jié)果表明，突變株侵染細(xì)胞的脫壁比例明顯高于野生株，與對(duì)斑馬魚的攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，即鰻弧菌mltD基因突變株的毒力較野生株得到了增強(qiáng)。