鰻弧菌感染對兩種蝦Imd免疫通路相關(guān)基因表達(dá)及非特異性免疫因子的影響.pdf

1、中國明對蝦和脊尾白蝦作為重要的養(yǎng)殖蝦類，在我國沿海均有廣泛分布。隨著市場需求的加大，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷增加，養(yǎng)殖過程中環(huán)境的惡化使得養(yǎng)殖蝦類的抗病力下降，伴隨病害的發(fā)生，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，通過對比不同種蝦類的抗病能力，發(fā)掘和分析免疫相關(guān)基因及非特異性免疫因子，研究其免疫調(diào)控規(guī)律，深入研究蝦類的免疫機(jī)制，探討提高其抗病力的方法與途徑，改良種質(zhì)，培養(yǎng)抗病品系，是解決當(dāng)前蝦類工廠化養(yǎng)殖困擾的有效途徑。
　　甲殼動物的免疫系統(tǒng)屬于非特異

2、性免疫系統(tǒng)，此系統(tǒng)主要是通過數(shù)量有限的模式識別蛋白識別異己后激活相關(guān)信號通路，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化抗微生物因子，激活體液免疫和細(xì)胞免疫，從而實現(xiàn)對外來異物的全面防御。非特異性免疫產(chǎn)生的免疫防御因子主要有各類識別因子、抗菌肽、抗病毒因子、細(xì)胞激活因子、凝集素、溶血素、凝血因子和具有免疫功能作用的各類酶如溶菌酶、氧化酶類、一氧化氮合酶等。對甲殼動物Imd信號通路的研究源于果蠅和家蠶免疫防御信號通路的發(fā)現(xiàn)。果蠅的Imd信號通路參與抵御革蘭氏陰性菌的

3、侵染，介導(dǎo)先天性免疫防御反應(yīng)。此通路通過細(xì)胞的模式識別受體（PRRs）識別病原體特有的病原相關(guān)分子模式（PAMPs），在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)一系列信號級聯(lián)放大反應(yīng)，將信號傳遞到細(xì)胞核上的核轉(zhuǎn)錄因子Relish，啟動通路下游免疫因子、抗菌肽、氧化酶等基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗菌作用。在已知中國明對蝦Relish基因情況下，本研究用同源克隆的方法獲得了與中國明對蝦位于同一條Imd信號通路上的Imd基因cDNA全長序列，和脊尾白蝦此通路的Relish基因全長，

4、并通過鰻弧菌刺激后中國明對蝦和脊尾白蝦Imd通路相關(guān)基因的表達(dá)及非特異性免疫因子的變化情況，初步了解 Imd通路相關(guān)基因在兩種養(yǎng)殖蝦類免疫識別中的作用及兩種蝦類在抗病力方面的差異。
　　根據(jù)genebank中已提交的節(jié)肢動物門有關(guān)物種的Imd基因和Relish基因序列設(shè)計兼并引物得到核心片段，利用3'、5'RACE技術(shù)獲得兩端序列，經(jīng)拼接得到中國明對蝦Imd基因和脊尾白蝦Relish基因全長。中國明對蝦Imd基因全長784bp，其

5、中5'-UTR45bp，3'-UTR231bp，開放閱讀框483bp，編碼160個氨基酸，分子量18123.64 D，理論等電點為8.022，屬于CDD超家族，含有一個位于C端的死亡結(jié)構(gòu)域，與凡納濱對蝦的IMD死亡結(jié)構(gòu)域基本一致，與果蠅的IMD蛋白及人類腫瘤壞死因子的受體交互蛋白 R1P1具有較高的相似性。脊尾白蝦Relish基因全長2141bp，開放閱讀框1983bp，編碼660個氨基酸，相對分子量為75270 D。具有NF-kB核轉(zhuǎn)

6、錄因子特有的IPT結(jié)構(gòu)域，屬于RHD-n超家族成員。
　　將中國明對蝦和脊尾白蝦在養(yǎng)殖基地暫養(yǎng)一段時間后，通過預(yù)實驗確定注射鰻弧菌的濃度為107CFU/mL，隨后用鰻弧菌注射兩種蝦開始正式實驗。記錄兩種蝦的死亡率，檢測中國明對蝦Imd基因和脊尾白蝦Relish基因的相對表達(dá)量，以及兩種蝦類非特異性免疫酶活的變化來研究兩種蝦類抗病力的情況及Imd信號通路相關(guān)基因在兩種蝦類體內(nèi)的功能和相互關(guān)系。結(jié)果顯示，中國明對蝦在感染鰻弧菌早期死亡

7、速率較脊尾白蝦快，感染12小時后中國明對蝦死亡速率減慢，而脊尾白蝦死亡率仍成直線上升趨勢，直至48小時兩種蝦均不再出現(xiàn)死亡個體，實驗結(jié)束時中國明對蝦的累積死亡率要高于脊尾白蝦。鰻弧菌的刺激會導(dǎo)致Imd通路相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，但Relish基因在上調(diào)后逐漸恢復(fù)至原有水平。兩種蝦的非特異性免疫酶活力在受感染后均有不同程度的升高，中國明對蝦的非特異免疫酶活48小時后即與對照組差異不大，脊尾白蝦各免疫酶活力約96小時后恢復(fù)至正常值。這些結(jié)果表明