比較兩種干眼模型小鼠淚腺及其全身非特異性免疫反應的研究.pdf

1、目的：
　　淚液生成不足型干眼模型和蒸發(fā)過強型干眼模型分別模擬淚液生成不足型干眼及蒸發(fā)過強型干眼，是主要的兩種干眼模型。目前東莨菪堿誘導的淚液生成不足型干眼模型已經被證實角結膜出現(xiàn)廣泛的炎癥，并且淚腺被廣泛的炎癥因子浸潤，但目前在蒸發(fā)過強型干眼小鼠模型中淚腺的炎癥情況及結構改變還不明確。本課題旨在研究這兩種干眼模型小鼠的淚腺結構改變，以及免疫細胞在淚腺和頸部淋巴結中的分布情況。
　　方法：
　　(1)取132只4-6周

2、齡的雌性C57BL/6小鼠，60只小鼠飼養(yǎng)于智能環(huán)境控制系統(tǒng)(ICES)中作為實驗組(E)，在放入ICES后1周，2周，4周，6周后分別取出小鼠淚腺及頸部淋巴結，分別標記為E1，E2，E4，E6組。12只C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于正常環(huán)境中，同時連續(xù)5天皮下注射東莨菪堿(0.5mg/0.2ml)，一天四次，作為東莨菪堿組(SCOP)。60只C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于正常環(huán)境中，不予任何處理作為正常對照組(N)。
　　(2)使用伊紅-蘇

3、木素染色檢測放入ICES誘導后不同時間點即E1，E2，E4，E6組，SCOP組及正常對照組的小鼠淚腺的大體形態(tài)結構變化。
　　(3)使用透射電子顯微鏡觀察E1，E2，E4，E6組，SCOP組及正常對照組小鼠淚腺組織的超微形態(tài)結構變化。
　　(4)使用免疫組織化學染色檢測E1，E2，E4，E6組，SCOP組及正常對照組小鼠淚腺組織的T淋巴細胞表面標記物CD4，CD8，CD11b，CD103，CD45，用以觀察各組小鼠淚腺組織中

4、免疫細胞的浸潤情況。
　　(5)最后使用流式細胞儀計數分析E1，E2，E4，E6組，SCOP組及正常對照組小鼠頸部引流淋巴結內的CD4，CD8陽性T淋巴細胞的比例，檢測是否存在由東莨菪堿阻滯膽堿能神經通路以及ICES誘導的干燥環(huán)境應激引起的小鼠全身非特異性免疫反應。
　　結果：
　　(1)HE染色后普通光學顯微鏡下可見ICES組相比正常小鼠，淚腺腺泡體積增大，而SCOP組腺泡體積變小萎縮，淚腺結構破壞，間質被淋巴細胞及

5、纖維組織替代。我們假設正常組的腺泡面積為1，檢測SCOP組，ICES誘導組E1，E2，E4，E6組中各組腺泡面積平均值與正常組腺泡面積大小的比值分別為0.6，1.03，1.19，1.12，1.05?？梢奡COP組的淚腺腺泡面積顯著小于正常組(P=0.01)和ICES誘導組(P＜0.05)。并且，我們還發(fā)現(xiàn)ICES組中單個淚腺腺泡的面積比正常對照組稍大(P＜0.001)。
　　(2)透射電鏡下可見ICES組小鼠淚腺腺泡胞質內有多量的

6、分泌顆粒聚集，證實光學顯微鏡下所見的ICES組腺泡體積增大的原因很可能是這些分泌顆粒的聚集，相反，SCOP組腺泡胞質內分泌顆粒數量比正常對照組少，分泌顆粒的體積比正常對照組小。正常組，SCOP組，E1，E2，E4，E6組中單個腺泡內分泌小泡的面積總和所占的比例分別為0.0015±0.0007,0.0009±0.0005,0.0015±0.0006,0.0019±0.0009,0.0015±0.0007,0.0015±0.0012?？梢奍

7、CES誘導組和正常對照組中的小鼠淚腺單個腺泡胞質中分泌小泡面積總和顯著大于SCOP組(P＜0.001)。另外我們還發(fā)現(xiàn)，在E2組這一比例顯著高于正常組(P＜0.001)。正常組，SCOP組，ICES誘導組E1，E2，E4，E6組中淚腺腺泡中的分泌小泡的直徑分別為0.65±0.19，0.41±0.11，0.76±0.17，0.75±0.15，0.75±0.17，0.65±0.16?？梢奍CES誘導組和正常對照組中的分泌小泡的直徑顯著大于S

8、COP組(P＜0.001)。另外，ICES誘導組中的E1，E2，E4組的分泌小泡的直徑顯著大于正常對照組(P＜0.001)。
　　(3)免疫組織化學染色顯示淚腺中CD4陽性淋巴細胞數量在正常對照組和ICES誘導組顯著低于SCOP組(P＜0.001)，ICES組淚腺組織中CD4陽性T淋巴細胞數量在各時間段與正常組相比沒有太大變化。CD8陽性淋巴細胞數量在E1，E2和E3組較正常組低，而E1和E6組較SCOP組低(P＜0.05)。CD

9、103陽性細胞數量在ICES組較正常組高，但比SCOP組低(P＜0.05)。CD11b陽性淋巴細胞數量在ICES組較SCOP組低(P＜0.05)，除E2組比正常組高外，其余時間點的數量與正常組相似。CD45陽性細胞數量在ICES組較SCOP組低(P＜0.05)，除E2和E4組比正常組高外，其余時間點與正常組相似。
　　(4)流式細胞術分析各組小鼠頸部引流淋巴結內的CD4，CD8陽性T淋巴細胞占所有淋巴細胞的比例，結果發(fā)現(xiàn)ICES組

10、2周時CD4陽性T細胞的比例最高，隨后4周這一比例逐漸減少;ICES組2周時CD8陽性T細胞的比例最低，隨后4周這一比例逐漸增加。SCOP組CD4陽性T細胞的比例與ICES組相比無明顯差異，CD8陽性T細胞的比例則較ICES組的低。各組CD4與CD8的比例均在正常范圍內，因此干燥環(huán)境刺激并未引起小鼠的全身非特異性免疫反應。
　　結論：
　　(1)ICES組小鼠的淚腺結構完整，腺泡體積增大，腺泡內分泌顆粒聚集，SCOP組小鼠的