空腸彎曲菌未知基因cj1199對(duì)紅霉素耐藥性和適應(yīng)性的功能研究.pdf

1、空腸彎曲菌是一種非常重要的食源性致病菌，是全球范圍內(nèi)感染性腹瀉常見(jiàn)的病原菌之一，同時(shí)也多種動(dòng)物的共生菌。人類感染空腸彎曲菌的主要來(lái)源為被污染的水和動(dòng)物性食品，如乳制品和未煮熟的肉類等?？漳c彎曲菌感染常引起急性、自限性腸炎，也會(huì)導(dǎo)致全身感染甚至引起嚴(yán)重的并發(fā)癥一格林巴利綜合癥。一旦出現(xiàn)嚴(yán)重或持久感染，或免疫力低下者感染就需要使用抗生素進(jìn)行治療。大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類是臨床常用的抗彎曲桿菌感染的藥物。近年來(lái)空?qǐng)鰪澢鷹U菌對(duì)氟喹諾酮類的耐藥問(wèn)題

2、日益嚴(yán)重，使得大環(huán)內(nèi)酯類在治療感染時(shí)顯得尤為重要。其中紅霉素自上個(gè)世紀(jì)70年代開(kāi)始應(yīng)用于腸道感染的治療，泰樂(lè)菌素作為畜禽專用抗生素被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。目前的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥問(wèn)題日益呈現(xiàn)，但是其機(jī)制尚未完全明確，適應(yīng)性相關(guān)研究也剛剛起步，這對(duì)控制耐藥的產(chǎn)生與傳播非常不利。本實(shí)驗(yàn)室郝海紅博士對(duì)不同水平紅霉素耐藥的空腸彎曲菌NCTC11168和81-176進(jìn)行芯片分析篩選耐藥菌中的差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示在這兩種

3、細(xì)菌的差異基因中有5個(gè)未知功能的基因表達(dá)模式相同，其中cj1199的表達(dá)量在NCTC11168中隨耐藥性增高而增高。根據(jù)NCBI搜索到的該基因的核酸和氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析該基因是一種亞鐵依賴型氧化還原酶，結(jié)合郝海紅博士的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，我們推測(cè)該基因參與了細(xì)菌體內(nèi)氨基酸的合成以及細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的應(yīng)激從而輔助了細(xì)菌對(duì)紅霉素耐藥性和適應(yīng)性的產(chǎn)生。本研究選取cj1199為目的基因研究其功能及在空腸彎曲菌對(duì)紅霉素耐藥過(guò)程中所發(fā)揮的作用，為

4、防止耐藥性的產(chǎn)生和傳播提供理論指導(dǎo)和支撐，從而保障用藥的安全性和有效性。首先構(gòu)建載體，采用同源重組的方法構(gòu)建cj1199基因的缺失突變體；通過(guò)各種不同的表型實(shí)驗(yàn)分析該基因缺失對(duì)細(xì)菌本身可能會(huì)造成的影響；通過(guò)基因芯片技術(shù)進(jìn)行差異基因篩選，從而深入分析該基因的功能及對(duì)耐藥的影響。
　　 采取反向PCR和重疊延伸PCR兩種方法進(jìn)行載體的構(gòu)建。反向PCR法要求先擴(kuò)增cj1199及其上下游約2000 bp左右的基因片段，然后連接pGEM-

5、T easy載體。用分別攜帶BamH I和Sma I酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增載體全長(zhǎng)，同時(shí)用攜帶有相同酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增cat基因，將產(chǎn)物回收后用上述兩種酶進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，用T4 DNA lingase連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)驗(yàn)證無(wú)誤后擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒。重疊延伸PCR法要求擴(kuò)增攜帶有cat同源臂的cj1199上半段基因和下半段基因，然后將這兩個(gè)基因與cat進(jìn)行重疊延伸，得到的基因片段連接pGEM-

6、T easy載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒。結(jié)果通過(guò)反向PCR法順利獲得目標(biāo)載體。重疊延伸PCR法不成功。
　　 將構(gòu)建好的載體與NCTC11168混勻后共同孵育，進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，將混合體系涂布于氯霉素抗性平板，篩選突變體。同時(shí)制備電轉(zhuǎn)化載體細(xì)胞，加入載體混勻，2450V、200Ω、25μF條件下持續(xù)電擊5 sec，加入預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，輕柔混勻，涂布含有氯霉素抗性的MH瓊脂平板，篩選突變體。結(jié)果顯示電轉(zhuǎn)化和自然轉(zhuǎn)化都成功獲得插

7、入缺失突變體，經(jīng)PCR及測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證無(wú)誤。
　　 以母源標(biāo)準(zhǔn)菌為對(duì)照組用基因芯片技術(shù)篩選缺失突變體中差異表達(dá)的基因。采用Real-time RT-PCR的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)置四組生物學(xué)重復(fù)，經(jīng)SAM分析后總共篩選得到23個(gè)差異基因。其中2個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，都與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)；21個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，有6個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，分別參與了天冬氨酸/谷氨酸以及鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)；5個(gè)氨基酸生物合成相關(guān)基因，參與了亮氨酸和色氨酸的生物合成；5個(gè)為細(xì)胞表面結(jié)

8、構(gòu)，其中有兩個(gè)與鐵刺激相關(guān)；2個(gè)假定蛋白，其余3個(gè)難以歸類。根據(jù)差異片段功能推測(cè)：cj1199基因影響了亮氨酸的生物合成，進(jìn)而影響了抗性短肽的合成，對(duì)紅霉素用藥初期細(xì)菌的存活做出了貢獻(xiàn)，使得細(xì)菌產(chǎn)生主要耐藥機(jī)制的幾率增加；該基因還影響了天冬氨酸/谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響了細(xì)菌的能量及碳的供應(yīng)，對(duì)細(xì)菌在腸道內(nèi)的定殖和生長(zhǎng)做出了貢獻(xiàn)。
　　 隨后進(jìn)行了一系列的表型檢測(cè)。測(cè)定突變體的生長(zhǎng)力、競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)力、在紅霉素中的競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)力以及在亮氨酸缺失

9、培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)力，與母源標(biāo)準(zhǔn)菌相比，突變體的生長(zhǎng)力沒(méi)有明顯變化，但競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)力明顯下降，在紅霉素中的競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)力下降更為明顯。在亮氨酸缺失培養(yǎng)基中突變體的生長(zhǎng)力明顯低于完全培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)力，也低于相同培養(yǎng)基中標(biāo)準(zhǔn)菌的生長(zhǎng)力。測(cè)定突變體對(duì)不同藥物的耐藥性，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)菌沒(méi)有明顯區(qū)別：采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)紅霉素作用下突變體的通透性，發(fā)現(xiàn)高于母源標(biāo)準(zhǔn)菌的通透性，推測(cè)突變體對(duì)紅霉素的耐受性降低。用紅霉素誘導(dǎo)耐藥，發(fā)現(xiàn)突變體表現(xiàn)為較難誘導(dǎo)、較難

10、獲得高水平耐藥菌株。
　　 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了用于空腸彎曲菌基因敲除的載體，運(yùn)用同源重組的方法成功構(gòu)建缺失突變體，并對(duì)突變體進(jìn)行了差異基因的篩選和相關(guān)表型測(cè)試。突變體在各種競(jìng)爭(zhēng)的環(huán)境中都表現(xiàn)出了較弱的競(jìng)爭(zhēng)力，且細(xì)胞通透性增高，難以產(chǎn)生耐藥菌株。說(shuō)明在臨床條件下突變體很快會(huì)被其他優(yōu)勢(shì)菌群替代，尤其是在紅霉素藥物作用情況下該菌株競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)處于弱勢(shì)的同時(shí)產(chǎn)生耐藥風(fēng)險(xiǎn)也明顯降低。據(jù)差異基因功能推測(cè)，cj1199基因影響到了亮氨酸的