禾谷鐮孢菌β-微管蛋白基因定點(diǎn)突變及敲除對(duì)多菌靈敏感性和基因表達(dá)譜的影響.pdf

1、微管是構(gòu)成真核生物細(xì)胞骨架的主要成分，它在細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程，例如有絲分裂，細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等方面起著重要作用。微管的基本組成單位是α-/β-微管蛋白動(dòng)態(tài)異二聚體，而β-微管蛋白基因是多菌靈等苯并咪唑類(lèi)殺菌劑的作用靶標(biāo)，其特異位點(diǎn)的突變將引起對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑的抗藥性。小麥赤霉病是世界范圍內(nèi)一種重要的流行性病害，不僅嚴(yán)重影響產(chǎn)量，而且降低小麥品質(zhì)。禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)是引起赤霉病的最主要病原菌之一。它可以產(chǎn)

2、生包括脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(Trichothecenes，DON)和雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)在內(nèi)的多種真菌毒素及次生代謝物質(zhì)，引起人類(lèi)和哺乳動(dòng)物中毒，嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的健康。因此人們以減輕病害為目的，開(kāi)發(fā)了一系列綜合防治策略。其中化學(xué)防治，尤其是在花期噴施多菌靈等苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，為我國(guó)近30年來(lái)有效防治赤霉病發(fā)揮了重要作用。但是，目前已知道在蘇皖等小麥主產(chǎn)區(qū)，禾谷鐮孢菌對(duì)微管蛋白抑制劑多菌靈普遍產(chǎn)生了抗藥性，局部地

3、區(qū)防治效果下降甚至喪失。本文通過(guò)以不同方式點(diǎn)突變基因，研究了禾谷鐮孢菌兩個(gè)β-微管蛋白基因變異對(duì)多菌靈敏感性及主要生物學(xué)性狀的影響，為禾谷鐮孢菌的抗藥性治理提供了重要的理論依據(jù)。
　　 利用體外人工點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建了禾谷鐮孢菌β2-微管蛋白基因(β2-tub)(FGSG_06611.3)編碼第50位氨基酸(TAC→TGC/Tyr→Cys)、167位氨基酸(TTT→TAT/Phe→Tyr)、200位氨基酸(TTC→TAC/Phe→

4、Tyr)和198位氨基酸(GAG→CAG/Glu→Gln)或(GAG→AAG/Glu→Lys)的突變片段。通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將突變片段導(dǎo)入禾谷鐮孢菌β2-tub敲除體，同源置換篩選標(biāo)記基因，從而成功獲得了禾谷鐮孢菌β2-tub定點(diǎn)突變體。對(duì)這些突變體的藥敏性及生物學(xué)性狀研究結(jié)果表明，禾谷鐮孢菌β2-tub第50位氨基酸突變(TAC→TGC)可導(dǎo)致該菌對(duì)多菌靈低抗，第167位氨基酸突變(TTT→TAT)可導(dǎo)致該菌對(duì)多菌靈中抗，第20

5、0位氨基酸突變(TTC→TAC)可導(dǎo)致該菌對(duì)多菌靈中抗，第198位氨基酸突變(GAG→AAG)可導(dǎo)致該菌對(duì)多菌靈高抗，第198位氨基酸突變(GAG→CAG)可導(dǎo)致該菌對(duì)多菌靈低抗。不同位點(diǎn)氨基酸殘基的改變可引起不同水平的抗藥性。然而，這些不同位點(diǎn)的點(diǎn)突變體與野生型敏感菌株相比，在菌絲生長(zhǎng)速率、無(wú)性和有性生殖能力及致病力等方面無(wú)顯著差異。利用在線服務(wù)器(http:∥www.expasy.ch/swissmod/)，對(duì)禾谷鐮孢菌β2-tub

6、進(jìn)行同源模建，獲得其三維分子結(jié)構(gòu)模型，將研究的突變位點(diǎn)標(biāo)記在β2-tub分子模型上，發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)可能構(gòu)成了一個(gè)苯并咪唑分子的結(jié)合域。
　　 同時(shí)，禾谷鐮孢菌中還存在一個(gè)β1-微管蛋白基因(β1-tub)(FGSG_09530.3)，本研究在體外構(gòu)建了以潮霉素為篩選標(biāo)記的β1-tub敲除載體，通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將敲除片段導(dǎo)入之前獲得的β2-微管蛋白基因定點(diǎn)突變體和野生型菌株中，獲得禾谷鐮孢菌β1-tub敲除突變體。通過(guò)測(cè)

7、定菌株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)特性、生殖生長(zhǎng)能力、致病力及對(duì)多菌靈敏感性等生物學(xué)特性，來(lái)研究β1-tub在禾谷鐮孢菌生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)多菌靈抗藥性中的作用。結(jié)果表明，β1-tub敲除突變體菌絲生長(zhǎng)變慢、致病力降低，但是無(wú)性生殖能力增強(qiáng)。所有菌株在敲除β1-tub后對(duì)多菌靈的抗性水平增加，同時(shí)β2-tub的表達(dá)水平上升，說(shuō)明β1-tub對(duì)β2-tub的表達(dá)及抗藥性具有負(fù)調(diào)控作用。利用構(gòu)巢曲霉強(qiáng)啟動(dòng)子連接禾谷鐮孢菌β2-tub，構(gòu)建了β2-tub過(guò)表達(dá)載體。通

8、過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將突變片段導(dǎo)入禾谷鐮孢菌β2-tub敲除體，同源置換篩選標(biāo)記基因，從而成功獲得了禾谷鐮孢菌β2-tub過(guò)表達(dá)突變體。結(jié)果表明，除了分生孢子產(chǎn)量提高以外，β2-tub過(guò)表達(dá)突變體其它生物學(xué)表型的變化不顯著。但是其對(duì)多菌靈的敏感性顯著降低，說(shuō)明β2-tub可能是多菌靈的作用靶標(biāo)。β2-tub的表達(dá)水平與對(duì)多菌靈的敏感性有關(guān)，但是它是一個(gè)次要的抗性機(jī)制，敏感菌株β2-tub過(guò)表達(dá)后最低抑制濃度仍然小于1.4μg·mL-1

9、。利用在線服務(wù)器，對(duì)禾谷鐮孢菌β1-tub進(jìn)行同源模建，獲得其三維分子結(jié)構(gòu)模型，將上述研究的突變位點(diǎn)標(biāo)記在β1-tub分子模型上，發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)同樣可能構(gòu)成了一個(gè)苯并咪唑分子的結(jié)合域。比對(duì)β1-tub和β2-tub的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)除了240位氨基酸存在差異，與多菌靈抗性有關(guān)的特異位點(diǎn)的密碼子序列相同。這可能與藥劑識(shí)別及兩個(gè)基因?qū)Χ嗑`的敏感性差異有關(guān)。
　　 近年來(lái)，禾谷鐮孢菌全基因組測(cè)序工作的完成加速了對(duì)禾谷鐮孢菌致病相關(guān)

10、基因的發(fā)掘，同時(shí)也為從基因組水平上認(rèn)識(shí)禾谷鐮孢菌致病分子機(jī)理提供了一個(gè)新的平臺(tái)。本研究對(duì)禾谷鐮孢菌野生型菌株2021，β2-tub敲除突變體DN83和β2-tub定點(diǎn)突變體F167Y進(jìn)行高通量標(biāo)簽測(cè)序。每個(gè)樣品測(cè)序共獲得大約六百萬(wàn)個(gè)原始標(biāo)簽。去除一些低質(zhì)的標(biāo)簽，2021、DN83和F167Y分別獲得5678673，6013236和5893596個(gè)有效序列，分別對(duì)應(yīng)94393，84202和103338個(gè)有效標(biāo)簽。所有有效標(biāo)簽與禾谷鐮孢菌數(shù)

11、據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，15％的有效標(biāo)簽可以對(duì)應(yīng)特異性的參考基因。對(duì)表達(dá)差異基因的分析結(jié)果表明，這些樣本在基因類(lèi)型和基因表達(dá)豐度上存在較大差異。敲除突變體DN83與野生型菌株2021相比，246個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1883個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。14個(gè)功能性的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)顯著下調(diào)，17個(gè)研究證實(shí)與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、無(wú)性生殖能力和致病力有關(guān)的蛋白激酶表達(dá)顯著下調(diào)。同時(shí)，在突變體中，多個(gè)參與致病的基因較野生型菌株表達(dá)亦顯著下調(diào)。14個(gè)與藥劑和有毒物質(zhì)輸出有關(guān)的三磷酸腺苷

12、結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-Binding Cassette transporter)表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明，β2-tub除了具有和β1-tub參與組裝微管的功能以外，還可能通過(guò)與上述這些基因互作，參與調(diào)節(jié)禾谷鐮孢菌的重要生命活動(dòng)。定點(diǎn)突變體F167Y與野生型菌株2021相比，1036個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，401個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，β2-tub167位定點(diǎn)突變能夠激活異戊二烯途徑和單端孢霉烯途徑，從而增強(qiáng)DON的合成。