過表達TLP對瘢痕形成的影響及基因干預評價.pdf

1、目的：TGF-β1在細胞內通過下游Smad發(fā)揮介導作用，在創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成和攣縮過程中的主要因子是Smad3，已證實抑制Smad3基因的表達能有效減少病理性瘢痕的形成。新近發(fā)現(xiàn)一種胞內蛋白TLP，能夠阻斷Smad3而不影響其他信號通路。本課題選用復制缺陷型腺病毒作為基因治療的載體，將TLP基因轉入體外瘢痕成纖維細胞，探討對細胞生物學性質的影響；并利用瘢痕動物模型，研究體內改善創(chuàng)傷愈合和治療瘢痕增生的效果。 方法：①正常皮膚、增

2、生性瘢痕、瘢痕疙瘩組織進行HE、Masson染色，實時熒光定量PCR比較三種組織中TGF-β1、Smad3、TLP mRNA表達；②用AdMaxTM Kit D腺病毒包裝系統(tǒng)構建含TLP基因的復制缺陷型重組腺病毒Ad5-TLP，體外感染三種不同來源成纖維細胞；③MTT法檢測實驗組(Ad5-TLP)、陰性對照組(Ad5)和空白對照組各成纖維細胞的增殖，構建成纖維細胞膠原網(wǎng)架FPCL比較增生性瘢痕成纖維細胞不同組的收縮指數(shù)；④在新生SD大鼠

3、背部線性切口模型與新西蘭大耳兔兔耳增生性瘢痕模型上進行TLP基因治療，實驗組注射構建的重組腺病毒Ad5-TLP，分別采取2周、4周的鼠背瘢痕組織進行HE染色后定量計算瘢痕組織面積，用游標卡尺測量1周、2周、1月、3月的兔耳瘢痕組織的平均厚度，比較療效。 結果：⑴正常皮膚、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩組織學存在明顯差異；三種組織中TGF-β1 mRNA表達無差異(P=0.9826)，Smad3、TLP mRNA表達具有顯著差異(PSmad

4、3=0.0017；PTLP=0.0380)；⑵成功構建重組腺病毒Ad5-TLP，病毒顆粒物理滴度為5～6×1012opu/ml，純度1.3～1.5，病毒有效滴度為4.5×109 pfu/ml，陰性對照病毒有效滴度為7.5×109 pfu/ml；成纖維細胞感染Ad5-TLP組表達TLP明顯增高(P<0.01)；⑶各種組織成纖維細胞在實驗組和對照組中的增殖無明顯的差異(P>0.05)；增生性瘢痕成纖維細胞感染Ad5-TLP后，F(xiàn)PCL凝膠塊

5、較對照組和空白組收縮更快(P<0.05)，而FPCL中未加入細胞的凝膠塊則沒有發(fā)生任何收縮；⑷成功構建瘢痕動物模型，術后2周時，SD大鼠實驗組傷口的平均面積(12266±2755)較對照組平均面積(18794±3754)小(P<0.01)，術后1月實驗組(11070±1490)與對照組(11790±1757)面積沒有明顯差異(P=0.2987)；兔耳瘢痕注射藥物后1周，腺病毒對照組的厚度全部較注射前增厚(-17.24±7.94％)，高濃

6、度TLP組(5.625×108 pfu/ml)部分較注射前增厚，效果不如空白對照組(P<0.05)；低濃度TLP組(5.625×107 pfu/ml)在1周、2周、1月時效果最佳，至3月時所有創(chuàng)面改善，四組之間沒有明顯的差異(P>0.05)。 結論：本實驗從組織學與分子生物學兩種不同的角度證實了增生性瘢痕與瘢痕疙瘩的不同性質，TGF-β信號通路中各種因子的表達水平直接影響瘢痕形成的方向和轉歸。腺病毒與過表達TLP基因均不影響正常