γ射線-質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合解析YdiV二聚體及YdiV-FlhD的結(jié)構(gòu).pdf

1、蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者，生命的遺傳信息最終主要通過蛋白質(zhì)的方式得到表達(dá)。而蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用形成的復(fù)合物（簡稱蛋白質(zhì)復(fù)合物）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)主要的存在形式，執(zhí)行著細(xì)胞的主要功能。蛋白質(zhì)是以氨基酸為基本單位按照一定順序脫水縮合形成的聚合物，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，解析蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)對(duì)分子水平上闡明生命活動(dòng)的基本規(guī)律具有重要的參考價(jià)值。因此，建立新型蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析方法有助于深入了解蛋白質(zhì)的作用并促進(jìn)其結(jié)構(gòu)和功能的研究。

2、r>　　YdiV是一個(gè)變異的EAL結(jié)構(gòu)域蛋白，對(duì)細(xì)胞的移動(dòng)性有負(fù)調(diào)節(jié)作用。YdiV蛋白的表達(dá)量受細(xì)菌群體感應(yīng)分泌的自我誘導(dǎo)物分子的調(diào)控，并且能介導(dǎo)大腸桿菌兩套群體感應(yīng)系統(tǒng)的相互作用。flhDC作為鞭毛表達(dá)的主導(dǎo)操縱子處于鞭毛表達(dá)整個(gè)流程最上游且最先被轉(zhuǎn)錄和翻譯，它能否順利表達(dá)也成為其他一切鞭毛蛋白表達(dá)的前提。已有研究表明，YdiV蛋白與FlhD蛋白的相互作用能影響細(xì)菌的移動(dòng)性。YdiV分子通過擠入FlhD4C2內(nèi)部兩個(gè)flhD亞基形成的

3、環(huán)狀結(jié)構(gòu)與FlhD4C2復(fù)合物發(fā)生結(jié)合。結(jié)合YdiV蛋白以后，flhDC的轉(zhuǎn)錄輔助因子活性喪失，下游基因轉(zhuǎn)錄受限，抑制了鞭毛蛋白的表達(dá)。
　　EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白在溶液中通常是以二聚體的形式存在，YdiV結(jié)構(gòu)的一個(gè)不對(duì)稱單元中包括兩個(gè)YdiV分子(MolA和MolB)，當(dāng)YdiV蛋白與FlhD4C2蛋白質(zhì)復(fù)合物發(fā)生相互作用時(shí)會(huì)改變YdiV的這種二聚作用。因此，研究YdiV-YdiV同源二聚體的結(jié)構(gòu)，確定二聚后的結(jié)合位點(diǎn)，為研究Ydi

4、V與FlhD4C2作用的結(jié)合機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　本研究以生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分析化學(xué)及環(huán)境毒理學(xué)為背景，結(jié)合高效液相色譜、質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提出利用γ-射線照射產(chǎn)生羥基自由基對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物形成前后蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行氧化標(biāo)記、聯(lián)合蛋白酶解和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究解析YdiV-YdiV、YdiV-FlhD復(fù)合物結(jié)構(gòu)的方法。論文主要包括以下五個(gè)部分的內(nèi)容:
　　論文第一章對(duì)蛋白質(zhì)的基本資料、研究對(duì)象YdiV蛋白的基本資料

5、、YdiV蛋白結(jié)構(gòu)研究現(xiàn)狀等作了簡要概述，介紹了目前蛋白質(zhì)研究的技術(shù)手段進(jìn)展、發(fā)展趨勢(shì)。在文獻(xiàn)綜述的基礎(chǔ)上分析了當(dāng)前蛋白質(zhì)研究所面臨的問題，提出了將γ-射線羥基自由基氧化標(biāo)記技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以及分子對(duì)接技術(shù)等聯(lián)合，用已知結(jié)構(gòu)的YdiV-YdiV、YdiV-FlhD蛋白質(zhì)復(fù)合物為研究對(duì)象，建立生理?xiàng)l件下水溶液中微量蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析的新方法。
　　論文第二章選用與本論文研究對(duì)象分子量相當(dāng)?shù)拇蟮鞍譈SA為目標(biāo)蛋白，應(yīng)用光

6、譜學(xué)方法對(duì)不同輻照條件下蛋白質(zhì)信息變化的研究，優(yōu)化并確定照射方案和蛋白質(zhì)表面氨基酸側(cè)鏈的標(biāo)記技術(shù)。隨著輻照劑量的增加，自由基對(duì)蛋白質(zhì)的氧化程度明顯增強(qiáng)，結(jié)合在蛋白質(zhì)片段上的氧原子增加，引起氨基酸基團(tuán)附近微環(huán)境發(fā)生明顯改變，熒光光譜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一點(diǎn)。而吸收光譜實(shí)驗(yàn)表明照射反應(yīng)并未明顯改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。通過實(shí)驗(yàn)我們解決了γ-射線停止照射后溶液中蛋白質(zhì)繼續(xù)氧化的問題，完善了時(shí)間、劑量可控的蛋白質(zhì)及其復(fù)合物γ-射線樣品照射羥基自由基氧化標(biāo)記方法

7、，拓寬了γ-射線輻照技術(shù)在蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析方面的應(yīng)用范圍。
　　論文第三章解析了YdiV-YdiV二聚體的結(jié)構(gòu):對(duì)YdiV蛋白質(zhì)單體及YdiV-YdiV二聚體應(yīng)用上一章節(jié)中γ-射線羥基自由基氧化標(biāo)記技術(shù)方法進(jìn)行輻照標(biāo)記，使用胰蛋白酶分別將氧化標(biāo)記前后的蛋白酶解，對(duì)YdiV單體和YdiV-YdiV二聚體酶解產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜分離、質(zhì)譜分析檢測(cè)確定各多肽片段的氧化標(biāo)記程度，并對(duì)同一肽段照射前后的氧化標(biāo)記程度進(jìn)行比較，確定氧化標(biāo)記程度

8、減小的(182-188)SFEPFIR多肽片段為YdiV-YdiV二聚體的結(jié)合部位。
　　論文第四章解析了YdiV-FlhD蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，解析方法與上一章節(jié)中相似。通過胰蛋白酶特異性酶解氧化標(biāo)記前后的YdiV、FlhD蛋白單體及YdiV-FlhD復(fù)合物獲得酶解產(chǎn)物，并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，比較分析氧化標(biāo)記前后同一個(gè)肽在單體和復(fù)合物中氧化標(biāo)記程度的變化，最終確定YdiV-FlhD蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合部位分

9、別為:YdiV側(cè)鏈中的(153-161)AVFDGLFTR、(167-176)SFIQQQITHR、(177-183)SFEPFIR多肽片段及FlhD側(cè)鏈中的(238-245)MHTSELLK、(261-266)HIYDINLSYLLLAQR、(273-293)GINEEMATTLAALTLPQMVKI和(294-305)LAETNQLVCHFR片段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有研究報(bào)道中提供的蛋白構(gòu)象模型相一致，驗(yàn)證了我們方法的準(zhǔn)確性、科學(xué)性。