檸檬苦素合成關(guān)鍵基因citLGT轉(zhuǎn)化柑橘的研究.pdf

1、我國(guó)是世界最大的柑橘生產(chǎn)國(guó)，栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。近年來我國(guó)除了穩(wěn)步提升柑橘罐頭的生產(chǎn)和出口外，也在不斷推進(jìn)橙汁加工業(yè)的發(fā)展進(jìn)程。目前在橙汁加工中仍存在一些難題需要克服，其中榨汁后出現(xiàn)的“延遲苦味”(delayed bitterness)問題是限制臍橙等橙汁加工業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素。延遲苦味現(xiàn)象是由酶催化的檸堿等苦味物質(zhì)的生物合成引起的。研究發(fā)現(xiàn)，檸檬苦酸A-環(huán)內(nèi)酯(limonoate A-ring lactone，LARL)是檸

2、堿合成的直接前體，它在果實(shí)正常成熟過程中逐漸被檸檬苦素UDP-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(1imonoidUDP-glycosyltransferases，LGTase)糖基化為配糖體(LG)，而在果實(shí)受到機(jī)械損傷等外界環(huán)境脅迫時(shí)就會(huì)轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈苦味的檸堿。因而，可以通過改變LARL在果實(shí)中的積累從而影響LARL向檸堿的轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步影響后苦味形成。本實(shí)驗(yàn)從溫州蜜柑中克隆了檸檬苦素UDP-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因citLGT，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化調(diào)控

3、其在轉(zhuǎn)基因錦橙中的異位表達(dá)，為探討該基因影響后苦味性狀的分子機(jī)制和基因工程改良柑桔延遲苦味性狀提供了新的思路和材料。取得的階段性結(jié)果有以下幾方面:
　　1.檸檬苦素類似物糖基轉(zhuǎn)移酶基因citLGT編碼序列及RNAi功能序列的克隆
　　根據(jù)前人的研究報(bào)道，設(shè)計(jì)特異引物，從溫州蜜柑基因組中擴(kuò)增獲得citLGT基因編碼序列;參考RNA干擾原理及RNAi載體構(gòu)建策略，設(shè)計(jì)三對(duì)特異引物分別從citLGT基因不同位置擴(kuò)增獲得三段長(zhǎng)分別為

4、268bp、176bp和302bp特異性序列作為RNA干擾目的片段。
　　2.組成型啟動(dòng)子(CaMV35S)控制的citLGT基因的超量表達(dá)和RNAi抑制表達(dá)載體的構(gòu)建
　　將citLGT基因克隆到載體pMD19-T上，三段RNAi干擾序列分別克隆到PGEM-T載體上，然后分別構(gòu)建了citLGT基因的植物超量表達(dá)載體p35S:citLGT和三個(gè)RNAi抑制表達(dá)載體p35S:eitLGT-RNAi-1、p35S:citLGT-

5、RNAi-2、p35S:citLGT-RNAi-3。另外，還構(gòu)建了只含有RNAi抑制表達(dá)載體正、反義片段間隔序列查耳酮合成酶基因（CHSA）內(nèi)含子（intron）的對(duì)照載體p35S:intron。
　　3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的相關(guān)植物表達(dá)載體對(duì)柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
　　將構(gòu)建的citLGT基因的相關(guān)植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)化有延遲苦味的錦橙，經(jīng)GUS染色和PCR檢測(cè)篩選共獲得了40株轉(zhuǎn)基因植株。
　　4.

6、轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因的整合分析
　　從獲得的不同載體轉(zhuǎn)基因株系中分別選取三株，大量提取葉片基因組DNA，分別對(duì)提取的DNA中的GUS基因進(jìn)行southern印記雜交分析外源基因在轉(zhuǎn)基因植株基因組中的整合情況。結(jié)果表明，外源基因已經(jīng)成功整合到轉(zhuǎn)基因錦橙基因組中。
　　5.轉(zhuǎn)基因植株中citLGT基因的表達(dá)分析
　　從得到的轉(zhuǎn)基因植株分別提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后以actin基因?yàn)閮?nèi)參、野生型錦橙植株為對(duì)照進(jìn)行q