柑橘轉(zhuǎn)化酶基因家族成員的分離及表達(dá)研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文柑橘轉(zhuǎn)化酶基因家族成員的分離及表達(dá)研究姓名：安新民申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：果樹學(xué)指導(dǎo)教師：張上隆2002.5.1浙江大學(xué)博士學(xué)位論文：柑橘轉(zhuǎn)化酶基固家族成員的分離及表選研充( 2 0 0 2 )中文摘要柑橘是我國(guó)重要果品之一。近年來(lái)我國(guó)水果產(chǎn)量全面增長(zhǎng)，果品購(gòu)銷迅速?gòu)馁u方市場(chǎng)轉(zhuǎn)向買方市場(chǎng)，特別是隨著我國(guó)加入W T O ，柑橘將面臨市場(chǎng)國(guó)際化的激烈競(jìng)爭(zhēng)，提高柑橘果實(shí)品質(zhì)已是追在眉睫。含糖量是柑橘果實(shí)品質(zhì)構(gòu)成的重要指標(biāo)之

2、一，而且糖是酸、類胡蘿h 素和其它營(yíng)養(yǎng)成分及芳香物質(zhì)合成的基礎(chǔ)原料。而轉(zhuǎn)化酶是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，它包括幾種同工酶，參與蔗糖在柑橘果實(shí)的源庫(kù)分配，調(diào)控細(xì)胞分化和膨大以及發(fā)育，決定果實(shí)中糖的成分及比例，還參與對(duì)機(jī)械傷、病菌侵染和寒冷的響應(yīng)過(guò)程等。因此研究柑橘轉(zhuǎn)化酶相關(guān)基因具有重要的意義，可以從分子水平理解柑橘果實(shí)蔗糖積累與分解的分子機(jī)制，為通過(guò)基因工程改良柑橘品質(zhì)和科學(xué)調(diào)控果實(shí)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。本研究根據(jù)G e n B a n k 登記的植物液

3、泡和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)了4 對(duì)P C R 引物，采用我們改進(jìn)的濾紙吸附噬菌體一P C R 法篩選甜橙九噬菌體文庫(kù)；分別以溫州蜜柑、金柑和酸橙基因組D N A 為模板進(jìn)行P C R 獲得相關(guān)的轉(zhuǎn)化酶基因成員的片段；運(yùn)用S e qA i d I I 、C l u s t a l x 和B i o e d i t 軟件包對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化酶基因家族的7 個(gè)序列進(jìn)行了同源性分析和聚類分析；對(duì)不同成員進(jìn)行了S o u t h e r n

4、雜交分析；以金柑、酸橙為材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)化酶基因的特異性表達(dá)的初步研究一主要結(jié)果如下：1 ．從甜橙基因組文庫(kù)中篩選分離了甜橙液泡酸性轉(zhuǎn)化酶基因全長(zhǎng)序列( C S —V 1 1 ) ，該序列全長(zhǎng)6 9 4 2 b p ，包括1 個(gè)類似轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子序列、0 R F和下游序列，編碼5 8 8 個(gè)氨基酸( 圖4 ) ，該基因包括6 個(gè)外顯子和5 個(gè)內(nèi)含子，其中第2 個(gè)外顯子僅9 b p ，編碼3 個(gè)氨基酸( D P N 即天冬氨酸、脯氨酸和天冬

5、酰胺) ，是迄今為止在植物界發(fā)現(xiàn)的最小的外顯子。該基因與植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因同源性較高，推測(cè)定位于液泡，屬于甜橙液泡酸性轉(zhuǎn)化酶基因( C S —V 1 1 ) 。2 ．從甜橙基因組文庫(kù)中篩選分離了甜橙細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因( C S - C W l l ) ，己測(cè)定序列長(zhǎng)3 0 7 3 b p ，該序列編碼2 8 1 個(gè)氨基酸，包括3 個(gè)內(nèi)含子和2 個(gè)外顯其中第1 個(gè)外顯子僅9 b p ，編碼D P N ( 天冬氨酸、脯氨酸和天冬酰胺) ，