馬鈴薯液泡轉(zhuǎn)化酶活性調(diào)控分子機制研究.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界第四大糧食作物，在保障食品安全中具有重要地位。為了減小常溫貯藏產(chǎn)生的失水皺縮、病害傳播，腐爛及發(fā)芽等情況并延長加工周期，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通常將收獲的塊莖貯藏于低溫下，但是在低溫貯藏過程中，馬鈴薯塊莖低溫糖化所積累的還原糖導(dǎo)致油炸加工過程中產(chǎn)品色澤變深，口感變苦及有害物質(zhì)如丙烯酰胺的積累，從而嚴重影響了加工品質(zhì)。因此，馬鈴薯低溫糖化是塊莖油炸加工業(yè)的瓶頸。諸多研究表明，低溫下塊莖中轉(zhuǎn)化酶

2、酶活性持續(xù)上升是造成低溫糖化的重要因素。盡管馬鈴薯存在特異轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白，但關(guān)于轉(zhuǎn)化酶活性調(diào)控機制還不完全明確。
　　基于此，在本實驗室的前期工作的基礎(chǔ)上，本研究擬通過分析轉(zhuǎn)化酶StvacINV1和轉(zhuǎn)化酶抑制子StInvInh2B的互作蛋白組，從中篩選出與轉(zhuǎn)化酶StvacINV1活性調(diào)控相關(guān)的互作蛋白，并進行功能分析和鑒定，以明確StvacINV1的翻譯后調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.StvacINV1/StInvI

3、nh2B蛋白在低溫糖化抗/感基因型中的互作蛋白組分析
　　用馬鈴薯抗低溫糖化(S.berthaultii,CW2-1)和低溫糖化敏感(S.tuberosum,AC035)基因型作為材料，分別構(gòu)建酵母雙雜交文庫。以轉(zhuǎn)化酶StvacINV1和其特異的轉(zhuǎn)化酶抑制子StInvInh2B為餌蛋白，分別從兩個雜交文庫中篩選各自的互作蛋白組，并通過不同的假陽性排除方法篩選出潛在的互作蛋白。研究結(jié)果表明，StvacINV1從CW2-1文庫中篩選到

4、24個潛在互作蛋白，從AC035文庫中篩選到了3個潛在互作蛋白;而StInvInh2B從CW2-1文庫中篩選到8個潛在互作蛋白。潛在互作蛋白組生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，除了篩選得到StvacINV1新的抑制子外，還發(fā)現(xiàn)StvacINV1和StInvInh2B能分別和同一個蔗糖非酵解-1相關(guān)激酶(Sucrose non-fermenting-1(SNF1)-related protein kinases)SbSnRK1的α和β亞基(SbSnRK

5、1α，SbSnRK1β)互作，從而說明馬鈴薯StvacINV1的翻譯后調(diào)節(jié)可能是一種多蛋白互作的模式。
　　2.StvacINV1-StInvInh2B-SbSnRK1復(fù)合體及其對StvacINV1活性的體外調(diào)控研究
　　在煙草活體細胞內(nèi)對StvacINV1，StInvInh2B和SnRK1的互作進行了雙分子熒光互補驗證，表明這三個蛋白質(zhì)之間存在互作，推測其可能組成一個蛋白質(zhì)復(fù)合體并能調(diào)控其中StvacINV1的活性。通過真

6、核或原核表達，獲得了有活性的StvacINV1，StInvInh2B以及SbSnRK1α和SbSnRK1β亞基的重組蛋白，體外的酶活性實驗結(jié)果顯示，SbSnRK1β能封阻StInvInh2B的轉(zhuǎn)化酶抑制功能，而SbSnRK1α的磷酸化水平則能調(diào)控SbSnRK1β的功能。本研究首次揭示并證明StvacINV1-StInvInh2B-SbSnRK1組成了一個蛋白質(zhì)復(fù)合體，并通過SbSnRK1α的磷酸化水平，對StvacINV1的活性進行精細

7、調(diào)控。
　　3.SbSnRK1α基因在馬鈴薯低溫糖化中的作用
　　為了研究SbSnRK1在馬鈴薯低溫糖化過程中的功能，本研究分別構(gòu)建了SbSnRKα的超量和干涉載體，對低溫糖化敏感的基因型鄂馬鈴薯3號(E3)進行了遺傳轉(zhuǎn)化，并分別獲得了15超量和8個干涉轉(zhuǎn)基因株系。根據(jù)基因表達水平，分別對其中5個超量和4個干涉株系的相關(guān)生理生化指標進行了測定，結(jié)果表明超量株系塊莖在低溫貯藏30天后，轉(zhuǎn)化酶活性降低80～95％，還原糖含量也降