豬肺血管緊張素轉(zhuǎn)化酶分離純化及抑制機(jī)理研究.pdf

1、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶是(Angiotensin Converting Enzyme，ACE，EC.3.4.15.1)是一種二肽羧基的糖蛋白酶，參與調(diào)節(jié)血壓和高血壓的發(fā)生中起著重要的作用。為了對(duì)ACE的生化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能和ACE與抑制劑結(jié)合過(guò)程的研究，需要先制備出高純度和高活力的ACE。本論文從豬肺中制備分離純化得到高純度ACE，研究純化產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)，并選擇ACE抑制劑藥物賴諾普利(Lisinopril)和乳清來(lái)源的ACE抑制肽VSLPEW

2、，對(duì)ACE與抑制劑結(jié)合過(guò)程及抑制機(jī)理進(jìn)行研究，主要內(nèi)容如下:
　　新鮮的豬肺作為原料，勻漿后采用超聲波聯(lián)合胰蛋白酶對(duì)勻漿液進(jìn)行前處理后再提取豬肺ACE,結(jié)果顯示兩者聯(lián)合處理后可以顯著提高酶活力和提取率?？疾炝顺暡ㄌ幚砼c加入胰蛋白酶的工藝流程，并確定超聲預(yù)處理的最適條件為:超聲功率為360W，超聲時(shí)間為3 min，漿液比為1:5，用硫酸銨沉淀，將預(yù)處理后粗提勻漿液分別利用1.6 mg·mL-1和2.6 mg· mL-1兩種不同濃度

3、的硫酸銨分級(jí)沉淀，得到的粗酶液進(jìn)行透析。對(duì)透析酶液進(jìn)行離子交換-超濾離心操作，得到經(jīng)SDS-PAGE顯示是一條電泳帶的ACE純品。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)知，該ACE相對(duì)分子質(zhì)量約為69KDa比活力為0.1061U·mg-1，純化倍數(shù)29.48倍，酶活力總回收12.33％。
　　研究ACE酶學(xué)性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，豬肺ACE在偏弱堿性環(huán)境中具有較高的酶活力，其活力最大值在pH8.3左右，豬肺ACE的熱穩(wěn)定性較低，最適反應(yīng)溫度為

4、40℃?？疾炝嗽诓煌孜餄舛认碌拇呋磻?yīng)速率ACE對(duì)其的影響，雙倒數(shù)作圖法得出Lineweaver-Burk方程計(jì)算得到所提純的豬肺ACE的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)KM為2.7mmol·L-1，Vmax為8.1 nmol·min-1。
　　利用等溫滴定量熱法研究了奈諾普利(Lisinopril)、乳源ACEI VSLPEW與ACE結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到抑制劑Lisinopril、抑制肽VSLPEW抑制結(jié)合ACE的反應(yīng)焓變均為正