SbSnRK1對(duì)馬鈴薯液泡轉(zhuǎn)化酶活性調(diào)控的初步研究.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界上第四大的糧食作物，薯片和薯?xiàng)l等油炸加工是馬鈴薯加工的重要組成部分。馬鈴薯在低溫貯藏條件下，其塊莖會(huì)出現(xiàn)還原糖累積的低溫糖化現(xiàn)象。低溫糖化后的馬鈴薯塊莖在高溫油炸加工的過(guò)程中，油炸產(chǎn)品會(huì)變黑并產(chǎn)生苦味物質(zhì)，生成潛在的致癌物質(zhì)丙烯酰胺。降低低溫下塊莖中還原糖的累積無(wú)疑是防治該現(xiàn)象產(chǎn)生的有效途徑。前人研究表明，轉(zhuǎn)化酶在低溫糖化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，而且轉(zhuǎn)化酶及其抑制子與SbSnRK

2、1可能形成新的蛋白復(fù)合物StvacINV1-StInvInh2B-SbSnRK1，對(duì)轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。但StvacINV1-StInvInh2B-SbSnRK1蛋白質(zhì)復(fù)合體在植物體內(nèi)的亞細(xì)胞定位、SbSnRK1α的磷酸化位點(diǎn)、以及SbSnRK1α的轉(zhuǎn)錄水平的變化是否會(huì)導(dǎo)致其蛋白質(zhì)磷酸化水平的變化等都還不明確。同時(shí)，亞基SbSnRK1β在植物體內(nèi)是否也具有對(duì)轉(zhuǎn)化酶活性調(diào)控的功能也不得而知。為此，本研究分別從上述問(wèn)題入手，進(jìn)一步探究了Sn

3、RK1-StvacINV1-StInvInh2B復(fù)合體對(duì)轉(zhuǎn)化酶活性的調(diào)控作用。主要結(jié)果如下:
　　1.為了研究StvacINV1-StInvInh2B-SbSnRK1蛋白質(zhì)復(fù)合體的亞細(xì)胞定位，分別構(gòu)建了不同目標(biāo)基因融合紅色熒光蛋白的植物表達(dá)載體RFP-SbSnRK1α、RFP-SbSnRK1β、StvacINV1-RFP、StInvInh2B-RFP和液泡膜標(biāo)記基因融合綠色熒光蛋白的載體AtγTIP-GFP，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式

4、，將目標(biāo)基因與標(biāo)記基因共表達(dá)。結(jié)果顯示，SbSnRK1α、SbSnRK1β主要定位在液泡膜上，StInvInh2B在液泡膜和液泡中均有分布，StvacINV1則主要分布在液泡中。這些結(jié)果說(shuō)明，SbSnRK1在液泡膜或液泡內(nèi)與轉(zhuǎn)化酶及其抑制子形成了一個(gè)復(fù)合體SbSnRK1-StvacINV1-StInvInh2B，從而實(shí)現(xiàn)低溫條件下對(duì)馬鈴薯塊莖轉(zhuǎn)化酶活性的調(diào)控。
　　2.通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，成功構(gòu)建了SbSnRK1α的三個(gè)突變體:S

5、bSnRK1αT175A/S176A、SbSnRK1αT175A、SbSnRK1αS176A，經(jīng)過(guò)體外表達(dá)，獲得了純化的相應(yīng)蛋白質(zhì)，并在體外對(duì)這些突變體蛋白的活性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，SbSnRK1α的175位蘇氨酸突變后，不能被上游激酶磷酸化，從而不能影響StvacINV1的活性，而當(dāng)SbSnRK1α的176位絲氨酸突變后，仍對(duì)StvacINV1活性具有調(diào)控作用，這說(shuō)明第175位蘇氨酸為SbSnRK1α磷酸化位點(diǎn)。利用SbSnRK1α

6、 T175位點(diǎn)的磷酸化特異抗體，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系塊莖在低溫貯藏后的磷酸化水平進(jìn)行半定量檢測(cè)，結(jié)果顯示，SbSnRK1α超量的轉(zhuǎn)基因株系的磷酸化水平明顯高于對(duì)照品種鄂馬鈴薯3號(hào);而干涉的轉(zhuǎn)基因株系中，塊莖的磷酸化水平幾乎很難檢測(cè)到。這些結(jié)果表明，低溫貯藏后塊莖中SbSnRK1α的磷酸化水平與其轉(zhuǎn)錄豐度成正比，且磷酸化水平的高低可能直接影響了低溫條件下塊莖中轉(zhuǎn)化酶的活性。
　　3.為了研究亞基SbSnRK1β在馬鈴薯低溫糖化過(guò)程中的功能，

7、本研究分別構(gòu)建了SbSnRK1β的干涉和超量表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化鄂馬鈴薯3號(hào)和AC142，通過(guò)篩選獲得了超量和干涉效果較好的株系。干涉轉(zhuǎn)基因株系相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，4℃低溫貯藏30天后，塊莖的轉(zhuǎn)化酶活性與對(duì)照相比略有降低，而還原糖的含量與對(duì)照相比差異不明顯。由此推測(cè)，雖然SbSnRK1β表達(dá)降低后，轉(zhuǎn)化酶活性會(huì)略微降低，但活性的改變還不足以影響低溫貯藏后塊莖中還原糖的累積，這可能是由于SbSnRK1β被干涉后，其同源基因產(chǎn)生了功能互補(bǔ)的