硫磦呤類藥物安全性監(jiān)測體系的建立.pdf

1、抗代謝藥:硫鳥嘌呤(6-thioguanine,6-TG),6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)及硫唑嘌呤(Azathioprine,AZA)均為嘌呤拮抗劑,這類藥物通過干擾嘌呤代謝的所有環(huán)節(jié),抑制嘌呤核苷酸的合成,進而抑制細胞DNA、RNA及蛋白質的合成。在臨床上,硫嘌呤類藥物除用于治療急性白血病外,主要作為免疫抑制劑廣泛用于器官移植以及自身免疫疾病的治療。但是此類藥物的治療存在很大的個體差異。藥物個體療效的不確

2、定性和對于藥物嚴重毒副作用的顧慮都限制了硫嘌呤類藥物在患者中的使用,主要原因是臨床缺乏相應的預測方法,這一矛盾在國內尤為突出。
　　 目前,臨床上通過定期監(jiān)測服用硫嘌呤類藥物患者的血象來指導其合理用藥。研究發(fā)現(xiàn)藥物活性物質的水平和降低的紅細胞計數(shù)、降低的血小板計數(shù)、降低的白細胞計數(shù)、降低的中性粒細胞計數(shù)呈正相關[1]。因此定期進行常規(guī)的血細胞計數(shù)有助于診斷此類藥物的血液毒性,但是常規(guī)的血象監(jiān)測難以預測毒性的危險性,通常在血細胞計

3、數(shù)發(fā)生改變之前,骨髓已受到一定損害,在血常規(guī)改變之后,骨髓的造血功能已受嚴重影響,血中藥物活性物質濃度已高出正常治療濃度[2],導致硫嘌呤類藥物不良反應增多,甚至造成嚴重的醫(yī)療事故。
　　 眾多研究表明,硫嘌呤類藥物治療的個體差異與其代謝途徑密不可分。這類藥物本身均無生物活性,必須經(jīng)過體內一系列的酶代謝途徑,最終生成有活性的6-硫代鳥嘌呤核苷酸(6-thioguanine nucleotides,6-TGNs)產生細胞毒效應而發(fā)

4、揮療效,但其亦是骨髓抑制的主要原因。6-TGNs在體內的濃度決定了此類藥物的有效性和毒性。而巰嘌呤甲基轉移酶(thiopurine methyltransferase,TPMT)作為硫嘌呤類藥物代謝途徑中重要的代謝酶,競爭性抑制6-TGNs的生成,進而影響藥物的療效及毒副作用。臨床研究表明,TPMT活性在不同個體之間有很大的差異。如果患者TPMT活性較低或遺傳有TPMT缺陷,即使給予常規(guī)劑量的藥物,也會生成過多有活性的6-TGNs,大大

5、增加了骨髓抑制的風險[3,4],另一方面,具有TPMT高活性的患者,在常規(guī)劑量下卻很難達到治療效果,而且過多的甲基化產物的生成可能導致肝臟毒性的發(fā)生[5.6]。
　　 TPMT基因多態(tài)性是造成TPMT酶活性個體差異的主要原因,目前對于中國漢族健康人群的TPMT活性分布及基因多態(tài)性分布情況已見報道,漢族健康人群的TPMT活性呈正態(tài)分布,且TPMT*3C為最主要的突變等位基因[7]。TPMT基因突變導致TPMT活性降低[8],TPM

6、T野生純合子對應TPMT高活性,TPMT*3C突變基因雜合個體顯示TPMT中等活性,而突變純合子對應TPMT活性缺乏。鑒于以上情況,本研究對收集的114例自身免疫疾病患者進行了TPMT*3C的篩選和TPMT酶活性的檢測,以期建立硫嘌呤類藥物安全性監(jiān)測體系,為臨床提供個體化用藥依據(jù)。
　　 1.建立引物特異性TaqMan聚合酶鏈反應檢測TPMT*3C突變
　　 1.1標本來源
　　 114例自身免疫疾病患者,包括3

7、9例類風濕性關節(jié)炎,33例白塞綜合癥,22例干燥綜合癥,20例間質性肺炎。所入選的患者均為漢族人,性別、身高、體重不限,年齡范圍3—68,性別男性87例,女性27例。以直接調查方式獲得相關資料,包括:年齡、性別、體重、民族、合并藥物以及不良反應等。
　　 1.2方法
　　 參照OMEGA公司的SE Blood DNA Kit試劑盒說明書從患者全血標本中提取基因組DNA。應用引物特異性TaqMan聚合酶鏈反應(PS-Taq

8、Man PCR)檢測114例臨床標本的TPMT*3C突變。每個模板DNA分別用野生型引物探針對及突變型引物探針對檢測,野生型引物探針對反應管標為A管,Ct值記作CtA,突變型引物探針對反應管標為B管Ct值記作CtB,CtA與CtB的差值記作ΔCt。
　　 為保證PS-TaqMan PCR檢測結果的準確性和重復性。①每次檢測均設野生型和突變型質控模板,質控模板為經(jīng)過分型驗證的接近檢測濃度下限的DNA,兩種質控模板均需正確分型;②每

9、一樣本均用野生型和突變型兩套引物探針檢測,ΔCt需大于6或小于3,并且其中一個Ct值需小于30。前者是防止非特異性擴增對結果判斷的干擾,后者是杜絕由于標本中模板量不足或其他因素造成擴增體系效率不高而帶來的結果誤判。
　　 此法主要利用DNA聚合酶擴增過程中的保真性原理,適當人為擴大引物與模板結合時的錯配比例,把突變型模板與野生型模板之間一個堿基的差異放到可以通過簡單觀察兩者不同的實時熒光定量擴增曲線來區(qū)分。此法省去了傳統(tǒng)的限制性

10、片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)繁瑣的操作,快捷簡便適合于大規(guī)模的臨床樣本分析。
　　 1.3結果
　　 在所收集的114例全血標本中,篩查出2例TPMT*3C突變雜合子,經(jīng)基因公司測序表明擴增曲線圖有差別的兩例患者確實為基因突變。TPMT*1／*3C在本研究中的基因型頻率是1.8％。反應結束后,設置合適的基線(通常為3～8)和閾值(通常為最

11、強熒光信號的1／10),得到CtA及CtB值,若CtA<30且CtB—CtA>6,則樣本為TPMT*1型；若CtB<30且CtA—CtB>6,則樣本為TPMT*3C型；若CtA<30,CtB<30且｜CtB—CtA｜<3,則樣本為TPMT*1／*3C型。
　　 2.建立高效液相色譜法(HPLC)測定TPMT活性
　　 2.1標本來源
　　 114例自身免疫疾病患者,包括39例類風濕性關節(jié)炎,33例白塞綜合癥,22

12、例干燥綜合癥,20例間質性肺炎?；颊卟裳?個月內無輸血史,且均未服用硫嘌呤類藥物。所入選的患者性別、身高、體重不限,均為漢族,其中男87例,女27例,年齡3-68歲。以直接調查方式獲得相關資料,包括:年齡、性別、體重、民族、合并藥物以及不良反應等。
　　 2.2方法
　　 2.2.1樣品處理方法
　　 主要參照Weinshiboum及黃民教授報道的方法處理血標本[9]。應用高效液相色譜法(HPLC)測定114例

13、臨床標本的TPMT活性。①血標本處理:取肘靜脈血4ml,血樣置于肝素鋰抗凝管中,6小時內低溫離心分離紅細胞,生理鹽水洗滌三遍,離心棄上清,測紅細胞壓積,加入4倍冷蒸餾水裂解紅細胞,離心后取上層透明液,置于-20℃保存。②酶活性的測定:采用改良的高效液相色譜法測定紅細胞TPMT活性,用37℃時每小時每毫升壓實紅細胞生成6-MMP的納摩爾數(shù)來表示TPMT活性。取樣品于冰上解凍后,取紅細胞裂解液200μl,加入200μl(150mmol／L,

14、pH7.5)磷酸鉀緩沖液,40μl(SAM 200μmol／L,DTT2.0mmol／L,別嘌呤醇200μmol／L)SAM、DTT和別嘌呤醇的混合液,10μl(100mmol／L)6-MP后,將搖床置于37℃恒溫干燥箱中,樣本孵育1h后加入50μl(1mol／L)的鹽酸終止反應。上述混合物加入25μl(114mg／L)甲硝唑溶液作為內標,渦旋混勻。再加入0.8mL(pH9.5)氯化氨緩沖液,3ml的乙酸乙酯,渦旋2min,離心,取上層

15、液,重復萃取一次,共收集上層液4ml,37℃水浴氮氣吹干。用100μl流動相復溶,取20μl進樣分析。
　　 2.2.2標準曲線的制備
　　 以6-MMP標準液(56mg／L)為母液配制濃度為0.7,2.8,3.5,5.6,7,11.2mg／L的標準溶液。分別吸取200μl紅細胞裂解液于6支1.5mlEP管內,精密加入以上不同濃度的6-MMP對照品溶液10μl,(使加入200μl磷酸鉀緩沖液、40μlSAM、DTT和別嘌

16、呤醇的混合液和50μlHCL后,0.5ml反應液中6-MMP的濃度分別為14,56,70,112,140,224μg／L)。按上述血標本處理方法對TPMT進行孵化(不加入底物6-MP)和提取后,進行測定。以6-MMP與內標MNZ的峰高比定量,峰高比(y)與6-MMP濃度(x)做線性回歸,求回歸方程,繪制標準曲線。
　　 2.2.3回收率與精密度試驗
　　 分別吸取200μl紅細胞裂解液于1.5mlEP管中,精密加入高、中

17、、低(7,5.6,1.75 mg／L)3種濃度的6-MMP標準溶液10μl(使孵化反應后0.5ml反應液中6-MMP的濃度分別為140,112,35μg／L),再按上述血標本處理方法操作(不加入底物6-MP)并進行分析,求得6-MMP在紅細胞裂解液中的回收率。在同一天內和不同天間對以上3個濃度的6-MMP標準紅細胞裂解液樣品重復處理5批(不加入底物6-MP),并進樣分析,求日內和日間RSD。
　　 2.2.4TPMT穩(wěn)定性試驗<

18、br>　　 選取3份健康受試者的全血標本,將制得的紅細胞裂解液-70℃冰箱保存。分別將紅細胞裂解液反復凍融3次及-70℃冰箱保存30天后測定TPMT活性,與制備好時立即測定的TPMT活性結果進行比較。考察紅細胞裂解液樣本中TPMT在凍融、冰凍條件下存放不同時間的穩(wěn)定性。
　　 2.3結果
　　 2.3.16-MMP標準曲線
　　 以6-MMP與內標MNZ的峰高比定量,峰高比(y)與6-MMP濃度(x)做線性回歸

19、,回歸方程為:y=0.0018x+0.0768(n=6,r=0.9911),6-MMP濃度在14～224μg／L內具有良好的線性關系,通過標準曲線計算所得的6-MMP濃度是指紅細胞裂解液在孵化反應結束后,6-MMP在0.5ml反應液中的濃度。在上述條件下測得6-MMP的最低檢測濃度為6μg／L。
　　 2.3.2方法的回收率和精密度
　　 高、中、低3種濃度的平均回收率為92％,表明該方法具有較好的準確性。高、中、低3個

20、濃度日內及日間變異均小于7％,表明該方法具有較好的精確度。
　　 2.3.3TPMT活性的穩(wěn)定性
　　 紅細胞裂解液樣本在反復凍融3次及-70℃冰凍條件下存放四周后,TPMT活性與制備好立即測定的活性相近,表明紅細胞裂解液樣本在反復凍融3次及-70℃冰凍條件下存放四周后TPMT活性仍穩(wěn)定。
　　 2.3.4樣本的測定
　　 對收集的114例全血標本進行TPMT酶活性的測定,參考吳玨珩及黃民教授[10]所測

21、TPMT活性范圍:4.36～22.52 nmol／h·ml Packed RBC(平均活性為11.96±3.27 nmol／h·mlPacked RBC),發(fā)現(xiàn)兩例突變患者中有一例TPMT酶活性為3.71 nmol／h·ml Packed RBC低于下限值。
　　 結論:
　　 (1)本研究所建立的引物特異性TaqMan聚合酶鏈反應(PS-TaqMan PCR)法用于檢測TPMT*3C突變。該方法可靠、高通量且效率高,與

22、傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態(tài)性(PCR—RFLP)法相比,省去了繁瑣的操作,更簡便、準確,更適合大規(guī)模的臨床樣本分析。
　　 (2)對已經(jīng)服用硫嘌呤類藥物的患者,因此類藥物自身的干擾影響TPMT活性測定的結果,建議通過檢測TPMT*3C的突變?yōu)榕R床用藥提供依據(jù)。
　　 (3)由于篩查出的TPMT*3C基因突變例數(shù)太少,在本研究中還不能得出TPMT*3C突變雜合子TPMT平均活性明顯低于野生型TPMT基因(TPM

23、T*1)純合子的TPMT平均活性。因此還有待于大樣本的進一步研究。
　　 (4)對未服用硫嘌呤類藥物的患者,因TPMT活性能較好的預測早期藥物毒副作用的發(fā)生及治療療效,指導藥物治療劑量,建議通過測定TPMT的活性為臨床個體化給藥提供依據(jù)。
　　 (5)本實驗所建立的HPLC用甲硝唑做內標測定紅細胞裂解液中6-MMP濃度,兩者分離較好,且紅細胞裂解液中的內源性雜質不干擾6-MMP的測定。6-MMP在14～224μg／L內具