阿司匹林對多發(fā)性骨髓瘤的抗腫瘤效應及其增強硼替佐米細胞毒作用的分子機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　近年來,世界范圍內人口的迅速老齡化,使得多發(fā)性骨髓瘤( Multiple Myeloma, MM)的發(fā)病率明顯升高,位居血液腫瘤第2位,僅次于非何杰金淋巴瘤。盡管免疫調節(jié)劑與蛋白酶體抑制劑為代表的藥物極大地改善了MM預后,但是幾乎所有的MM患者最終出現(xiàn)疾病難治與復發(fā),至今仍屬不可治愈性疾病。作為核心藥物的硼替佐米(Bortezomib,BTZ),已被廣泛用于誘導、鞏固、挽救與維持治療等階段。然而,BTZ的持續(xù)應用

2、導致繼發(fā)性耐藥發(fā)生。近年來發(fā)現(xiàn)阿司匹林(Aspirin,ASA)在人結腸癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中具有抗癌與腫瘤預防作用。
　　本研究旨在通過觀察ASA在體外實驗與荷MM小鼠體內是否具有抗癌作用,并探討ASA抗骨髓瘤效應的作用機制,進一步分析ASA與BTZ在MM細胞系中相互作用及分子機制,為ASA臨床應用治療MM及增強BTZ療效提供理論與實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、采用CCK-8與PI染色方法,分別檢測不

3、同濃度ASA(0、2.5、5.0、10.0mmol/L)對地塞米松敏感與耐藥MM細胞系(MM1.S與RPMI-8226)的細胞增殖活性與細胞周期的影響,觀察ASA對MM細胞的抗癌效應。
　　2、采用Annexin V-FITC/PI染色法、比色法與Western blot方法,分別檢測ASA對MM細胞系凋亡率、Caspase-3、-8、-9活性與PARP蛋白表達的影響,分析ASA對MM細胞的促凋亡作用。
　　3、采用實時熒光

4、定量PCR和Western blot方法檢測ASA對MM細胞系Bcl-2、Bax與VEGF的mRNA與蛋白表達的影響,探討ASA在MM細胞中的抗癌機制。
　　4、通過建立人MM細胞移植瘤NOD/SCID小鼠動物模型,觀察ASA對荷瘤小鼠生存期與移植瘤生長的影響,探討ASA在體內的抗骨髓瘤作用。
　　5、采用CCK-8方法與Annexin V-FITC/PI染色方法,通過檢測ASA(2.5mmol/L)聯(lián)合BTZ(10nmol

5、/L)對MM1.S與RPMI-8226的細胞增殖活性與細胞凋亡的影響,分析ASA與BTZ在MM細胞中的藥物相互作用。
　　6、采用Western blot方法,檢測ASA、BTZ、ASA聯(lián)合BTZ分別處理MM細胞系后Akt磷酸化與Survivin蛋白水平,探討ASA對BTZ抗骨髓瘤作用的增敏機制。
　　結果:
　　1、ASA對MM1.S細胞與RPMI-8226細胞均有顯著的增殖抑制作用,這種作用在2.5~10mmol/

6、L范圍內呈劑量依賴性。在24~72h內,ASA對MM1.S細胞與RPMI-8226細胞的增殖抑制率呈時間依賴性。
　　2、在2.5~10mmol/L范圍內,ASA以劑量依賴性誘導MM1.S與RPMI-8226細胞凋亡。2.5~5mmol/L ASA對MM1.S細胞的凋亡誘導率高于RPMI-8226細胞,但10mmol/L ASA對兩種細胞的凋亡誘導率相同。
　　3、ASA處理MM1.S與RPMI-8226細胞后,G1期細胞比

7、例均呈劑量依賴性增高,而S期細胞比率相應地降低。
　　4、ASA處理MM1.S與RPMI-8226細胞后,Caspase-3活性均以濃度依賴性升高,同時伴隨Caspase-8與Caspase-9活性的明顯升高。
　　5、在2.5~10mmol/L范圍內,ASA促進MM1.S與RPMI-8226細胞的PARP蛋白(116KD)裂解,且呈劑量依賴性。
　　6、在MM1.S細胞與RPMI-8226細胞中,ASA以濃度依賴性下

8、調Bcl-2與VEGF mRNA與蛋白表達,而Bax mRNA與蛋白則呈濃度依賴性上調。
　　7、通過對NOD/SCID小鼠分別皮下接種MM1.S與RPMI-8226細胞(1×107個/只),成功地建立了荷骨髓瘤移植瘤小鼠動物模型,瑞氏染色與H-E染色顯示為典型的骨髓瘤細胞,總成瘤率為71.88％(23/32)。
　　8、與PBS對照組相比,ASA處理明顯抑制了荷MM細胞系(MM1.S細胞與RPMI-8226細胞)移植瘤小鼠

9、的腫瘤生長。
　　9、與PBS對照組相比,ASA處理顯著延長了荷MM細胞系(MM1.S細胞與RPMI-8226細胞)移植瘤小鼠的中位生存期(37.5dvs21d,p=0.035;35.5d vs21d,p=0.035)。
　　10、ASA與BTZ聯(lián)合組以時間依賴性抑制MM1.S與RPMI-8226細胞的增殖活性,且明顯高于ASA或BTZ單藥組。進一步分析ASA與BTZ的相互作用,發(fā)現(xiàn)二者在抑制MM細胞增殖中呈相加作用。

10、>　　11、在MM1.S與RPMI-8226細胞中,ASA與BTZ聯(lián)合組的細胞凋亡率均明顯高于ASA單藥組及BTZ單藥組。
　　12、ASA單藥可抑制MM細胞Akt-Thr308磷酸化;而BTZ單藥誘導MM細胞Akt-Thr308磷酸化。但ASA與BTZ聯(lián)合組則幾乎完全抑制MM細胞Akt-Thr308磷酸化。
　　13、ASA單藥與BTZ單藥抑制MM細胞的Akt-Ser473磷酸化。然而,與ASA或BTZ單藥相比,ASA與B

11、TZ聯(lián)合組顯著抑制Akt-Ser473磷酸化。
　　14、ASA單藥下調MM細胞Survivin蛋白水平;而BTZ單藥則上調MM細胞Survivin表達。ASA與BTZ聯(lián)合組較ASA單藥更顯著抑制MM細胞Survivin蛋白水平。
　　結論:
　　1、ASA在體內外均具有抑制MM細胞增殖的作用。
　　2、ASA通過線粒體與死亡受體兩條途徑誘導MM細胞凋亡。
　　3、ASA的抗MM作用不依賴于地塞米松的敏感性