阿司匹林對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的抗腫瘤效應(yīng)及其增強(qiáng)硼替佐米細(xì)胞毒作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:
　　近年來(lái),世界范圍內(nèi)人口的迅速老齡化,使得多發(fā)性骨髓瘤( Multiple Myeloma, MM)的發(fā)病率明顯升高,位居血液腫瘤第2位,僅次于非何杰金淋巴瘤。盡管免疫調(diào)節(jié)劑與蛋白酶體抑制劑為代表的藥物極大地改善了MM預(yù)后,但是幾乎所有的MM患者最終出現(xiàn)疾病難治與復(fù)發(fā),至今仍屬不可治愈性疾病。作為核心藥物的硼替佐米(Bortezomib,BTZ),已被廣泛用于誘導(dǎo)、鞏固、挽救與維持治療等階段。然而,BTZ的持續(xù)應(yīng)用

2、導(dǎo)致繼發(fā)性耐藥發(fā)生。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)阿司匹林(Aspirin,ASA)在人結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中具有抗癌與腫瘤預(yù)防作用。
　　本研究旨在通過(guò)觀察ASA在體外實(shí)驗(yàn)與荷MM小鼠體內(nèi)是否具有抗癌作用,并探討ASA抗骨髓瘤效應(yīng)的作用機(jī)制,進(jìn)一步分析ASA與BTZ在MM細(xì)胞系中相互作用及分子機(jī)制,為ASA臨床應(yīng)用治療MM及增強(qiáng)BTZ療效提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、采用CCK-8與PI染色方法,分別檢測(cè)不

3、同濃度ASA(0、2.5、5.0、10.0mmol/L)對(duì)地塞米松敏感與耐藥MM細(xì)胞系(MM1.S與RPMI-8226)的細(xì)胞增殖活性與細(xì)胞周期的影響,觀察ASA對(duì)MM細(xì)胞的抗癌效應(yīng)。
　　2、采用Annexin V-FITC/PI染色法、比色法與Western blot方法,分別檢測(cè)ASA對(duì)MM細(xì)胞系凋亡率、Caspase-3、-8、-9活性與PARP蛋白表達(dá)的影響,分析ASA對(duì)MM細(xì)胞的促凋亡作用。
　　3、采用實(shí)時(shí)熒光

4、定量PCR和Western blot方法檢測(cè)ASA對(duì)MM細(xì)胞系Bcl-2、Bax與VEGF的mRNA與蛋白表達(dá)的影響,探討ASA在MM細(xì)胞中的抗癌機(jī)制。
　　4、通過(guò)建立人MM細(xì)胞移植瘤NOD/SCID小鼠動(dòng)物模型,觀察ASA對(duì)荷瘤小鼠生存期與移植瘤生長(zhǎng)的影響,探討ASA在體內(nèi)的抗骨髓瘤作用。
　　5、采用CCK-8方法與Annexin V-FITC/PI染色方法,通過(guò)檢測(cè)ASA(2.5mmol/L)聯(lián)合BTZ(10nmol

5、/L)對(duì)MM1.S與RPMI-8226的細(xì)胞增殖活性與細(xì)胞凋亡的影響,分析ASA與BTZ在MM細(xì)胞中的藥物相互作用。
　　6、采用Western blot方法,檢測(cè)ASA、BTZ、ASA聯(lián)合BTZ分別處理MM細(xì)胞系后Akt磷酸化與Survivin蛋白水平,探討ASA對(duì)BTZ抗骨髓瘤作用的增敏機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、ASA對(duì)MM1.S細(xì)胞與RPMI-8226細(xì)胞均有顯著的增殖抑制作用,這種作用在2.5~10mmol/

6、L范圍內(nèi)呈劑量依賴性。在24~72h內(nèi),ASA對(duì)MM1.S細(xì)胞與RPMI-8226細(xì)胞的增殖抑制率呈時(shí)間依賴性。
　　2、在2.5~10mmol/L范圍內(nèi),ASA以劑量依賴性誘導(dǎo)MM1.S與RPMI-8226細(xì)胞凋亡。2.5~5mmol/L ASA對(duì)MM1.S細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率高于RPMI-8226細(xì)胞,但10mmol/L ASA對(duì)兩種細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率相同。
　　3、ASA處理MM1.S與RPMI-8226細(xì)胞后,G1期細(xì)胞比

7、例均呈劑量依賴性增高,而S期細(xì)胞比率相應(yīng)地降低。
　　4、ASA處理MM1.S與RPMI-8226細(xì)胞后,Caspase-3活性均以濃度依賴性升高,同時(shí)伴隨Caspase-8與Caspase-9活性的明顯升高。
　　5、在2.5~10mmol/L范圍內(nèi),ASA促進(jìn)MM1.S與RPMI-8226細(xì)胞的PARP蛋白(116KD)裂解,且呈劑量依賴性。
　　6、在MM1.S細(xì)胞與RPMI-8226細(xì)胞中,ASA以濃度依賴性下

8、調(diào)Bcl-2與VEGF mRNA與蛋白表達(dá),而B(niǎo)ax mRNA與蛋白則呈濃度依賴性上調(diào)。
　　7、通過(guò)對(duì)NOD/SCID小鼠分別皮下接種MM1.S與RPMI-8226細(xì)胞(1×107個(gè)/只),成功地建立了荷骨髓瘤移植瘤小鼠動(dòng)物模型,瑞氏染色與H-E染色顯示為典型的骨髓瘤細(xì)胞,總成瘤率為71.88％(23/32)。
　　8、與PBS對(duì)照組相比,ASA處理明顯抑制了荷MM細(xì)胞系(MM1.S細(xì)胞與RPMI-8226細(xì)胞)移植瘤小鼠

9、的腫瘤生長(zhǎng)。
　　9、與PBS對(duì)照組相比,ASA處理顯著延長(zhǎng)了荷MM細(xì)胞系(MM1.S細(xì)胞與RPMI-8226細(xì)胞)移植瘤小鼠的中位生存期(37.5dvs21d,p=0.035;35.5d vs21d,p=0.035)。
　　10、ASA與BTZ聯(lián)合組以時(shí)間依賴性抑制MM1.S與RPMI-8226細(xì)胞的增殖活性,且明顯高于ASA或BTZ單藥組。進(jìn)一步分析ASA與BTZ的相互作用,發(fā)現(xiàn)二者在抑制MM細(xì)胞增殖中呈相加作用。

10、>　　11、在MM1.S與RPMI-8226細(xì)胞中,ASA與BTZ聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于ASA單藥組及BTZ單藥組。
　　12、ASA單藥可抑制MM細(xì)胞Akt-Thr308磷酸化;而B(niǎo)TZ單藥誘導(dǎo)MM細(xì)胞Akt-Thr308磷酸化。但ASA與BTZ聯(lián)合組則幾乎完全抑制MM細(xì)胞Akt-Thr308磷酸化。
　　13、ASA單藥與BTZ單藥抑制MM細(xì)胞的Akt-Ser473磷酸化。然而,與ASA或BTZ單藥相比,ASA與B

11、TZ聯(lián)合組顯著抑制Akt-Ser473磷酸化。
　　14、ASA單藥下調(diào)MM細(xì)胞Survivin蛋白水平;而B(niǎo)TZ單藥則上調(diào)MM細(xì)胞Survivin表達(dá)。ASA與BTZ聯(lián)合組較ASA單藥更顯著抑制MM細(xì)胞Survivin蛋白水平。
　　結(jié)論:
　　1、ASA在體內(nèi)外均具有抑制MM細(xì)胞增殖的作用。
　　2、ASA通過(guò)線粒體與死亡受體兩條途徑誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡。
　　3、ASA的抗MM作用不依賴于地塞米松的敏感性