小豆蔻明抗多發(fā)性骨髓瘤多重效應及其分子機制.pdf

1、第一部分、小豆蔻明抗多發(fā)性骨髓瘤的多重效應
　　 目的：研究小豆蔻明對多發(fā)性骨髓瘤細胞活性、增殖、凋亡、周期及其血管新生的作用并初步探討其作用機制。
　　 方法：采用MTT 法檢測天然藥物對骨髓瘤細胞活性的影響；采用CCK-8 法驗證小豆蔻明對骨髓瘤細胞活性的作用；采用CCK-8 法檢測小豆蔻明對正常人單個核細胞（PBMNCs）活性的影響；采用EdU 法檢測小豆蔻明對骨髓瘤細胞增殖的影響；采用碘化丙啶（PI）單染法流式細

2、胞術檢測小豆蔻明對骨髓瘤細胞周期的影響；采用Annexin V FITC/PI 雙染法流式細胞術檢測小豆蔻明對骨髓瘤細胞凋亡的影響；采用吖啶橙（AO）、溴乙錠（EB）雙染熒光顯微鏡觀察小豆蔻明對骨髓瘤細胞凋亡形態(tài)的影響；采用Western blot 檢測小豆蔻明對骨髓瘤細胞caspase-3和PARP 活化的影響；采用小管形成試驗觀察小豆蔻明對血管新生的影響。
　　 結果：在篩選的4 種天然藥物中，小豆蔻明可以抑制骨髓瘤細胞的活

3、性；CCK-8實驗也證實小豆蔻明可以呈時間和劑量依賴性抑制骨髓瘤細胞活性，小豆蔻明對RPMI 8226、U266、ARH-773 種骨髓瘤細胞48h IC50分別為14.69、13.06、10.82μM；而小豆蔻明對正常人PBMNCs的活性影響較小，只有在高達200μM 濃度時，才對PBMNCs 顯示出一定的毒性作用；EdU 試驗顯示小豆蔻明可以明顯抑制骨髓瘤細胞增殖；流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，小豆蔻明可以將骨髓瘤細胞阻滯在G2/M 期，同時

4、可以顯著誘導骨髓瘤細胞凋亡；AO/EB 試驗證實了小豆蔻明可以誘導骨髓瘤細胞凋亡；Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，小豆蔻明可以誘導骨髓瘤細胞caspase-3和PARP 活化；小管形成試驗顯示小豆蔻明可以抑制血管新生。
　　 結論：小豆蔻明顯示出抗骨髓瘤多重效應，包括抑制骨髓瘤細胞活性與增殖、阻滯細胞周期、誘導凋亡、抑制血管新生等。小豆蔻明誘導凋亡與caspase 激酶活化有關。小豆蔻明抗骨髓瘤值得進一步深入研究。
　

5、　 第二部分、小豆蔻明調控多發(fā)性骨髓瘤NF-κB 通路的機制
　　 目的：研究小豆蔻明對多發(fā)性骨髓瘤細胞NF-κB 通路的調控機制。
　　 方法：采用Western blot 檢測小豆蔻明對骨髓瘤細胞NF-κB 活化的影響；采用免疫熒光試驗檢測小豆蔻明對骨髓瘤細胞NF-κB 亞細胞定位的影響；采用Western blot檢測小豆蔻明對骨髓瘤細胞NF-κB 上游IκBα活化、IKKα與IKKβ表達、AKT 活化的作用，研

6、究小豆蔻明對骨髓瘤細胞NF-κB下游抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、survivin、XIAP、cIAP-1、cIAP-2以及遷移相關蛋白ICAM-1、增殖相關蛋白COX-2和血管新生相關蛋白VEGF表達的影響；采用CCK-8 法觀察小豆蔻明聯(lián)合長春新堿或地塞米松對骨髓瘤細胞活性的影響。
　　 結果：小豆蔻明可以呈時間依賴性和劑量依賴性抑制骨髓瘤細胞NF-κB 亞基p65磷酸化；免疫熒光試驗顯示小豆蔻明可以抑制骨髓瘤細胞NF

7、-κB 核轉位；Western blot結果顯示小豆蔻明可以下調NF-κB 上游IκBα磷酸化水平，呈時間和劑量依賴性抑制IKKα與IKKβ表達，下調AKT 活化水平。而且，小豆蔻明可以呈時間依賴性抑制NF-κB下游一系列基因產物的表達，包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、survivin、XIAP、cIAP-1、cIAP-2以及遷移相關蛋白ICAM-1、增殖相關蛋白COX-2和血管新生相關蛋白VEGF。CCK-8 試驗顯示小豆蔻明

8、可以明顯提高長春新堿和地塞米松對骨髓瘤細胞活性的抑制作用。
　　 結論：小豆蔻明通過下調NF-κB 上游AKT 活化、IKKα與IKKβ表達、IκBα活化，從而抑制NF-κB 活化，并進一步抑制NF-κB下游與骨髓瘤發(fā)病相關蛋白的表達，這可能是小豆蔻明抗骨髓瘤多重效應的分子機制之一。
　　 第三部分、小豆蔻明調控多發(fā)性骨髓瘤STAT3 通路的機制
　　 目的：研究小豆蔻明對多發(fā)性骨髓瘤細胞STAT3 通路的調控機

9、制。
　　 方法：采用ELISA 試驗檢測小豆蔻明對骨髓瘤細胞IL-6分泌的影響；采用Westernblot 檢測小豆蔻明對骨髓瘤細胞STAT3 固有性活化的作用；采用免疫熒光試驗觀察小豆蔻明對骨髓瘤細胞STAT3 亞細胞定位的影響；采用IL-6 刺激RPMI 8226細胞后，Western blot 檢測小豆蔻明對IL-6 誘導的STAT3 活化的影響，以及小豆蔻明對IL-6誘導的活化的影響；采用Western blot 檢測

10、小豆蔻明對骨髓瘤細胞STAT3下游基因產物cyclin D1、Bcl-2、VEGF表達的影響。
　　 結果：小豆蔻明呈時間依賴性抑制U266細胞IL-6的分泌；Western blot 顯示小豆蔻明可以呈時間和劑量依賴性抑制U266細胞STAT3 固有性的活化；免疫熒光試驗顯示小豆蔻明可以抑制U266細胞STAT3 核轉位；Western blot 試驗發(fā)現(xiàn)IL-6 可以誘導RPMI 8226細胞STAT3 活化，而小豆蔻明可以