轉錄調控基因GmGT-2A轉化大豆與體系優(yōu)化研究.pdf

1、農作物的生長發(fā)育同外界環(huán)境密切相關,環(huán)境中物理和化學因素的變化例如干旱、鹽堿、凍害、低溫等脅迫因素會影響大豆的生長發(fā)育,嚴重時會導致大豆大幅度的減產。增加大豆的抗逆性是大豆改良的重要目標,同時對緩解我國大豆產業(yè)危機具有十分重要的意義。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展,轉基因技術已經成為植物耐逆育種的主要方法之一。
　　 本實驗以浙江省杭州國家大豆分中心保存的‘浙春3號’和‘中黃13’為研究材料,將轉錄因子GmGT-2A基因構建到不同

2、的載體導入大豆基因組中,從而調控耐逆相關功能基因的表達,以期獲得具有抵抗鹽害、干旱等非生物脅迫能力的大豆新種質。建立和優(yōu)化適合兩種實驗材料的遺傳轉化體系是成功獲得轉基因大豆的首要前提,本實驗主要采用大豆子葉節(jié)和大豆胚芽尖作為遺傳轉化體系的外植體,并研究影響兩種遺傳轉化的重要影響因子。取得如下主要研究成果:
　　 1、對農桿菌介導大豆子葉節(jié)遺傳轉化系統(tǒng)中消毒方法、消毒時間、外植體的大小、外植體的放置方式、6-BA在萌發(fā)階段和誘導階

3、段的最適濃度、影響芽伸長的培養(yǎng)基激素等幾個因素進行了優(yōu)化。以大豆的組培苗的污染率和萌發(fā)率為指標,氯氣消毒法平均污染率1.67％,萌發(fā)率高達98.33％,而NaClO結合70％乙醇的消毒方法平均污染率達到35.33％,萌發(fā)率也只有64.67％,結果顯示氯氣消毒法是最優(yōu)的消毒方法；以大豆種子的再生率為指標,研究氯氣消毒時間對種子活力的影響,當消毒時間為4-6小時達到零污染率,再生率也取得最大值88-89％,所以確定最佳氯氣的消毒時間為4-6

4、小時；以子葉節(jié)的再生率和誘導芽的質量為指標,確定了大豆以2／3子葉,以45°斜插于培養(yǎng)基中的形式獲得最好的誘導效果;以子葉節(jié)的再生率和帶有明顯主莖的芽數為指標,確定了在萌發(fā)培養(yǎng)基和誘導培養(yǎng)基分別添加6-BA的含量為0.5mg／L、2mg／L誘導效果最好,大豆叢生芽率達到最大值92％,并得出6-BA在大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)中萌發(fā)階段和誘導階段都起著重要的作用:本研究還探討了影響叢生芽伸長的幾個植物生長激素及其各自濃度,并確定了當ZT為0.15

5、mg／L,GA3為0.6mg／L,,6-BA為1mg／L的時候芽最高伸長頻率為78.33％TDZ對叢生芽的伸長有抑制作用。利用優(yōu)化后大豆子葉節(jié)遺傳轉化系統(tǒng),將構建于pBin438載體上的GmGT-2A成功導入到‘中黃13’中,獲得19個T0代轉基因株系經PCR檢測、構建特異性PCR檢測、抗逆性的初步鑒定,已將目的基因導入大豆基因組中。
　　 2、本實驗部分以大豆品種‘浙春3號’的胚芽尖為受體材料,將大豆轉錄因子GmGT-2A構建

6、于pCambia3300雙元載體上,利用農桿菌介導法導入大豆基因組中,為探討過量表達該基因以提高大豆對非生物脅迫的抗逆性準備材料。通過研究預培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的6-BA濃度、侵染時間等因子對轉化效率的影響,系統(tǒng)優(yōu)化了大豆的成熟胚芽尖轉化體系。單因素優(yōu)化實驗結果表明:預培養(yǎng)時間、6-BA濃度和侵染時間均對大豆遺傳轉化有顯著的影響,三者各自最優(yōu)條件分別為胚芽尖預培養(yǎng)時間1.5d,共培養(yǎng)基6-BA濃度8 mg／L和侵染時間10h。根據以

7、上結果設計三因素三水平正交試驗對轉化體系進行系統(tǒng)優(yōu)化,結果表明:以上因素對轉化效率的影響程度從大到小依次為:侵染時間、預培養(yǎng)時間和6-BA濃度；最佳轉化體系中各因素水平與單因素優(yōu)化結果一致。本研究獲得的最高平均轉化效率為5.67％。實驗還初步探討了IBA濃度對再生苗生根的影響,結果表明在生根培養(yǎng)基中不加入IBA比加入IBA時生根時間短,且生根數量多,移栽易成活。利用上述方法得到的抗性苗,經目的基因、標記基因和構建特異性的PCR檢測,表明