大豆體細(xì)胞胚再生體系的優(yōu)化和遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究.pdf

1、大豆是世界上重要的油料及植物蛋白質(zhì)來(lái)源,也是重要的經(jīng)濟(jì)作物。目前,大豆被公認(rèn)為遺傳轉(zhuǎn)化率較低的物種之一,無(wú)論是利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化,低壓滲透轉(zhuǎn)化,或是基因槍轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作,高效大豆再生體系的建立將是影響大豆轉(zhuǎn)化的重要步驟之一。本試驗(yàn)對(duì)不同基因型大豆體細(xì)胞胚的多種生長(zhǎng)因子進(jìn)行了研究,并優(yōu)化完善了不同基因型大豆體細(xì)胞胚的再生體系。同時(shí),在前期所建立的體細(xì)胞胚再生體系的基礎(chǔ)上,研究了基因槍-農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化,二者單獨(dú)轉(zhuǎn)化方法對(duì)大豆體細(xì)胞胚瞬時(shí)表達(dá)及

2、后期篩選對(duì)陽(yáng)性體細(xì)胞胚獲得的影響,初步建立高效的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)化體系。
　　為研究不同基因型大豆幼胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的能力,本研究以10個(gè)不同基因型的大豆為供試品種,于不同環(huán)境條件下播種,將所獲得的大豆幼胚進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)。結(jié)果顯示:1)同一基因型在不同生長(zhǎng)環(huán)境中所獲得的大豆幼胚,其誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的能力相差很大,總體表現(xiàn)為春季播種>溫室播種>秋季階段>夏季階段:(2)不同基因型大豆在相同的培養(yǎng)條件下,所獲得的幼胚,其誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的能力不同,

3、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)能力較高的品種是墾豐23,北4217,綏農(nóng)30和綏農(nóng)28。
　　選取上述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)能力較強(qiáng)的4個(gè)基因型(墾豐23,北4217,綏農(nóng)30,綏農(nóng)28),對(duì)其體細(xì)胞胚不同的生長(zhǎng)因子進(jìn)行探索研究。結(jié)果顯示:(1)液體培養(yǎng)基相對(duì)于固體培養(yǎng)基,更有利于體細(xì)胞胚的增殖;(2)2,4-D濃度5mg/L在降低體細(xì)胞胚的畸形率,提高其增殖速率上,效果較好;(3)當(dāng)體細(xì)胞胚團(tuán)的直徑為3mm時(shí),固體培養(yǎng)的各個(gè)品種表現(xiàn)出較高的增殖速率。對(duì)不同

4、直徑大小的體細(xì)胞胚進(jìn)行液體培養(yǎng)過(guò)程中,直徑為3mm,5mm和7mm,綏農(nóng)28和綏農(nóng)30的增殖速率沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的差異性,墾豐23和北4217的增殖速率在體細(xì)胞胚直徑為3mm和5mm時(shí)較高;(4)試驗(yàn)中,除了墾豐23在蔗糖含量為30 g·L-1的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至8-12 d時(shí),增殖速率最高,其單個(gè)體細(xì)胞胚4 d中增長(zhǎng)的體細(xì)胞胚數(shù)量為0.88個(gè)外,綏農(nóng)30,綏農(nóng)28,北4217和墾豐23的體細(xì)胞胚的增殖速率在液體/固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)4-8

5、d內(nèi)最高。
　　為研究大豆體細(xì)胞胚的遺傳轉(zhuǎn)化,本研究以 YFP為標(biāo)記基因,大豆北4217為供試品種,研究基因槍-農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化及二者單獨(dú)轉(zhuǎn)化方法對(duì)大豆體細(xì)胞胚瞬時(shí)表達(dá)的影響。對(duì)基因槍-農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化方法參數(shù)優(yōu)化結(jié)果表明,當(dāng)破裂膜的規(guī)格為1350 psi,射程距離為9 cm,農(nóng)桿菌OD600為0.3時(shí),瞬時(shí)表達(dá)量最高,共聚焦熒光顯微鏡下觀察亮點(diǎn)個(gè)數(shù)可達(dá)16.8個(gè)/體細(xì)胞胚團(tuán)。篩選培養(yǎng)12周后統(tǒng)計(jì)各種方法所得陽(yáng)性體細(xì)胞胚的生物量表明,后期