小麥成熟胚再生體系的建立及其遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥的遺傳改良，已成為育種研究的一個(gè)方向。再生體系和轉(zhuǎn)化體系的建立對(duì)基因工程育種具有重要意義。但小麥（Triticum aestivumL.）屬于異源六倍體植物,基因組龐大,重復(fù)序列多,再生能力差，遺傳轉(zhuǎn)化比較困難。本研究以小麥成熟胚為外植體，對(duì)影響再生的關(guān)鍵因素包括外植體類型及處理方式、植物激素種類和光照條件等進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，建立了穩(wěn)定的再生體系；并探索了農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥胚源愈傷組織的轉(zhuǎn)化條件，初步

2、建立了胚源愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化過程；另外，本研究首次嘗試了以幼胚的生長(zhǎng)點(diǎn)為受體，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)化，初步確定了幼胚生長(zhǎng)點(diǎn)直接轉(zhuǎn)化的可行性，以期為小麥轉(zhuǎn)基因育種提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　（1）以小麥成熟籽粒為起始材料，研究了外植體類型及處理方式、植物激素種類和光照條件等因素對(duì)小麥再生的影響。結(jié)果表明：①成熟胚的再生效率，優(yōu)于幼苗葉基切段，成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)率及再生率均高于幼苗葉基切段，且再生率

3、差異顯著；②完整胚在整個(gè)再生階段均表現(xiàn)較差，發(fā)芽率顯著高于切割胚，而愈傷誘導(dǎo)率和分化率又顯著低于切割胚；③附加2,4-D和Picloram均可以高頻率地誘導(dǎo)成熟胚愈傷組織的形成，但Picloram誘導(dǎo)形成的愈傷組織質(zhì)量較好，多為致密的淡黃色胚性愈傷組織，分化率高于2,4-D達(dá)2倍之多；④愈傷誘導(dǎo)階段光照培養(yǎng)，可以影響愈傷組織的質(zhì)量，提高分化率。成熟胚先黑暗培養(yǎng)14 d，再轉(zhuǎn)入光照條件下繼續(xù)誘愈培養(yǎng)，分化率顯著提高，可達(dá)22.84％。

4、r>　?。?）以Bobwhite成熟胚愈傷組織為受體，農(nóng)桿菌LBA4404（含
　　pCAMBIA3304-Tri101質(zhì)粒）為供體材料，研究了愈傷組織預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間和共培養(yǎng)方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明：①隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加，GUS瞬時(shí)表達(dá)率增加，但愈傷組織的再生能力下降，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為14 d時(shí)，愈傷組織的GUS瞬時(shí)表達(dá)率及再生能力均較好；②以O(shè)D600=1.0的農(nóng)桿菌重懸液，侵染處理3 h時(shí)，愈傷組織的GUS瞬

5、時(shí)表達(dá)率最高，在保證轉(zhuǎn)化率的前提下，再生能力較好；③在共培養(yǎng)階段進(jìn)行干燥處理，可明顯提高愈傷組織的GUS瞬時(shí)表達(dá)率及再生能力。在三個(gè)處理中，均輔以組織再生相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)再生相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的變化與愈傷組織的再生能力變化呈正相關(guān)。最終確定，小麥成熟胚預(yù)培養(yǎng)14 d后，農(nóng)桿菌侵染3 h，共培養(yǎng)階段經(jīng)干燥處理，是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)化的合適條件。
　　（3）以日齡1~3 d及7 d的小麥幼胚為受體，利用攜帶G

6、us基因的農(nóng)桿菌LBA4404侵染，恢復(fù)培養(yǎng)至3~5葉期時(shí)，取第三葉進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析；并做兩個(gè)優(yōu)化對(duì)比處理：①抽真空處理：在侵染過程中，0.1 MPa抽真空2 min；②干燥處理：在共培養(yǎng)階段，將幼胚轉(zhuǎn)入鋪有干燥無菌濾紙的平皿中。結(jié)果表明：GUS瞬時(shí)表達(dá)率隨日齡增加而降低，以2~3 d齡的幼胚為最高；抽真空和干燥處理均能顯著提高GUS瞬時(shí)表達(dá)率。最終，在優(yōu)化處理?xiàng)l件下，獲得77株轉(zhuǎn)化苗中，40株第三葉GUS染色顯示陽(yáng)性，高達(dá)5