2-甲氧基雌二醇通過GPER受體信號(hào)通路抑制人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖.pdf

1、目的：低氧、特殊藥物、異常的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)等因素均可以刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，使其表現(xiàn)出過度增殖的特性，進(jìn)而引起肺血管重塑以及肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)。雌激素代謝產(chǎn)物2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol,2ME)可以通過抑制肺血管炎癥及血管重塑，從而對(duì)肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)生保護(hù)性作用，然而其具體分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein-coupled estroge

2、n receptor,GPER)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種雌激素膜型受體，可以介導(dǎo)雌激素在心血管系統(tǒng)疾病中的保護(hù)性作用，然而該受體在肺循環(huán)中的表達(dá)及意義不清楚。新近研究發(fā)現(xiàn)，2ME是GPER受體的一種高親和力激動(dòng)劑。本研究以人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)(human pulmonary artery smooth muscle cell,hPASMC)胞為研究對(duì)象，探討2ME對(duì)低氧條件下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖活性的影響及其與 GPER受體信號(hào)通路之間的關(guān)系。<

3、br>　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞：將購(gòu)置的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第5-8代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的傳代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，隨機(jī)分為：A.常氧組、B.低氧組、C.低氧+2ME干預(yù)組、D.低氧+2ME+G15干預(yù)組。常氧組培養(yǎng)于37℃，充有5％CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)；各低氧組均培養(yǎng)于37℃，充有3%O2、5%CO2和92%N2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)；2ME干預(yù)組培養(yǎng)基中2ME濃度為0.2μM；G15干預(yù)組培養(yǎng)基中加

4、入GPER受體拮抗劑G15濃度為0.01μM，均孵育48h。
　　2.通過MTT試驗(yàn)比較各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞給予干預(yù)后48h細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　3.通過 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中增質(zhì)細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)及GPER受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　4.通過Western blot技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PCNA和GPER受體蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：

5、
　　1.成功獲得hPASMC傳代培養(yǎng)細(xì)胞。
　　2.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞條件干預(yù)48h后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示低氧組OD值高于其他各組；常氧組與低氧+2ME+G15組之間 OD值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；低氧+2ME組OD值最低。
　　3.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞條件干預(yù)48h后， RT-PCR結(jié)果顯示低氧組和低氧+2ME+G15組PCNA基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但較其他兩組顯著升高；低氧+2ME組與常氧組間PCNA轉(zhuǎn)錄水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。常氧組GP

6、ER基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他各組，低氧+2ME組和低氧+2ME+G15組GPER轉(zhuǎn)錄水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均高于低氧組。
　　4.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞條件干預(yù)48h后，Western blot結(jié)果顯示常氧組細(xì)胞PCNA蛋白水平顯著低于其他三組；低氧組和低氧+2ME+G15組 PCNA蛋白水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；低氧+2ME組PCNA蛋白水平顯著高于常氧組，但低于其他兩個(gè)低氧處理組。常氧組GPER受體蛋白表達(dá)水平高于其他各組；低氧組和低氧+2M