17β-雌二醇和2-甲氧基雌二醇對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響.pdf

1、目的:肺動(dòng)脈高壓(PAH)是一組由不同病因和發(fā)病機(jī)制引起的以肺血管阻力持續(xù)增加為特征的臨床綜合征。缺氧而致細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygen species，ROS)生成過(guò)多、清除不足而引起的氧化應(yīng)激是多種病理生理變化的基礎(chǔ)。ROS通過(guò)直接或間接途徑調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，最終導(dǎo)致肺血管重構(gòu)。超氧化物歧化酶(SOD)是抵抗ROS的第一道防線，而錳超氧化物歧化酶(MnSOD)是細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的主要清除劑。肺血管張力的維持有賴于氧化/

2、抗氧化酶系統(tǒng)的平衡，在PAH的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。本研究旨在通過(guò)建立去勢(shì)大鼠長(zhǎng)期慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓模型，探討17β-雌二醇(E2)和2-甲氧基雌二醇（2ME）對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，線粒體錳超氧化物歧化酶(MnSOD)活性及表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1、模型建立:健康雌性SD大鼠80只，按隨機(jī)數(shù)字表法平均分為8組，分別為假手術(shù)組、去勢(shì)組、假手術(shù)+低氧組、去勢(shì)+低氧組、去勢(shì)+E2組、去勢(shì)+低氧+

3、E2組、去勢(shì)+2ME組、去勢(shì)+低氧+2ME組。假手術(shù)組打開(kāi)腹腔找到雙側(cè)卵巢后不做處理直接還納縫合;去勢(shì)組行切除卵巢術(shù);假手術(shù)+低氧組行假手術(shù)后持續(xù)低氧（24h，8周）;去勢(shì)+低氧組切除卵巢后持續(xù)低氧;去勢(shì)+E2組切除卵巢后給予E2（20μg·kg-1·d-1）皮下注射;去勢(shì)+低氧+E2組切除卵巢后每天給予E2并且持續(xù)低氧;去勢(shì)+2ME組切除卵巢后給予2ME（240μg· kg-1·d-1）皮下注射;去勢(shì)+低氧+2ME組切除卵巢后每天給予

4、2ME并且持續(xù)低氧。連續(xù)飼養(yǎng)8周，以建立低氧肺動(dòng)脈高壓模型。
　　2、長(zhǎng)期低氧大鼠肺動(dòng)脈壓力變化:造模8周后，右心導(dǎo)管法測(cè)定大鼠平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)，以放血的方式處死大鼠。稱量法計(jì)算右心室肥大指數(shù)(right ventricule hypertrophy index，RVHI)，HE染色進(jìn)行肺小動(dòng)脈重塑(hypoxic pulmonary artery remode

5、ling，HPSR)觀察。
　　3、采用醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，透射電鏡下觀察肺組織各類細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　4、采用Fenton反應(yīng)及Griess顯色原理測(cè)定血清ROS水平。
　　5、采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清中SOD、Cu/ZnSOD、MnSOD水平。
　　6、采用反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)肺組織中MnSOD mRNA水平。
　　7、采用Western blot印跡檢測(cè)肺組織中MnSOD蛋白質(zhì)的表

6、達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠的一般狀況:低氧條件下的各組大鼠隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，毛色晦暗、虹膜暗紅、呼吸急促、食水量減少，活動(dòng)度逐漸減少，最終以靜臥為主，低氧8周過(guò)程中未出現(xiàn)死亡。與假手術(shù)組相比較，假手術(shù)+低氧組和去勢(shì)+低氧組大鼠體重增長(zhǎng)明顯緩慢;去勢(shì)+低氧+E2組和去勢(shì)+低氧+2ME組體重增長(zhǎng)速度減緩;去勢(shì)組、去勢(shì)+E2組和去勢(shì)+2ME組體重增長(zhǎng)速度無(wú)明顯變化。
　　2、各組大鼠肺動(dòng)脈壓力及RVHI變化:假手術(shù)+低

7、氧組、去勢(shì)+低氧組大鼠肺小動(dòng)脈管壁增厚管腔變窄明顯，mPAP、RVHI均顯著高于假手術(shù)組;去勢(shì)+低氧+E2組、去勢(shì)+低氧+2ME組大鼠上述形態(tài)學(xué)改變相對(duì)較輕，mPAP仍顯著高于假手術(shù)組，且兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而RVHI則與假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、各組大鼠肺小血管形態(tài)學(xué)變化:光鏡下，假手術(shù)組大鼠肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平連續(xù)，細(xì)胞分布均勻，大小、厚薄較一致，無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞水腫壞死，肺小動(dòng)脈管壁結(jié)

8、構(gòu)正常、管腔大。假手術(shù)+低氧組大鼠肺小動(dòng)脈管壁明顯增厚、結(jié)構(gòu)紊亂，紅染部分明顯增厚，中膜平滑肌細(xì)胞(SMC)增多，中膜(PAMT)增厚，管腔變窄，部分出現(xiàn)塌陷;假手術(shù)+低氧組更為顯著;去勢(shì)+低氧+E2組和去勢(shì)+低氧+2ME組肺小動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)介于假手術(shù)組與低氧組之間;去勢(shì)組、去勢(shì)+E2組和去勢(shì)+2ME組大鼠肺小動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)大致正常。
　　4、各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)變化:透射電鏡下，假手術(shù)組大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞可見(jiàn)較多的微絨毛，未見(jiàn)脫

9、落，板層小體未見(jiàn)斷裂;線粒體數(shù)目較多，輕微腫脹，未見(jiàn)嵴斷裂和消失;假手術(shù)+低氧組大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞腫脹，表面微絨毛脫落，明顯減少，排列欠整齊，板層小體重度減少，可見(jiàn)斷裂，線粒體腫脹，可見(jiàn)大部分嵴斷裂及膜融合消失，模糊不清，細(xì)胞核固縮;去勢(shì)+低氧組大鼠表面微絨毛脫落，顯著減少，板層小體顯著減少，可見(jiàn)斷裂，脫顆粒出現(xiàn)空泡，線粒體腫脹明顯，數(shù)目明顯減少，可見(jiàn)嵴斷裂和膜融合消失;去勢(shì)+低氧+E2組和去勢(shì)+低氧+2ME組大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞腫脹

10、，表面微絨毛脫落，中度減少，排列欠整齊，板層小體中度減少，可見(jiàn)斷裂，線粒體腫脹，可見(jiàn)嵴斷裂和膜融合消失，以及髓樣化;去勢(shì)組、去勢(shì)+E2組和去勢(shì)+2ME組大鼠可見(jiàn)輕度超微結(jié)構(gòu)改變，大致正常。
　　5、各組大鼠血清SOD、Cu/ZnSOD、MnSOD活性變化:與假手術(shù)組相比，去勢(shì)組、假手術(shù)+低氧組和去勢(shì)+低氧組大鼠SOD活性明顯降低，降低幅度逐組遞增，去勢(shì)+低氧組最為顯著;去勢(shì)+低氧+E2組和去勢(shì)+低氧+2ME組大鼠SOD活性降低;去

11、勢(shì)+E2組和去勢(shì)+2ME組大鼠SOD活性變化不明顯。MnSOD變化趨勢(shì)同前。各組間Cu/ZnSOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6、各組大鼠血清ROS水平:與假手術(shù)組相比，假手術(shù)+低氧組、去勢(shì)+低氧組ROS水平明顯升高;去勢(shì)+低氧+E2和去勢(shì)+低氧+2ME組ROS水平升高，升高幅度不及假手術(shù)+低氧組、去勢(shì)+低氧組組;去勢(shì)組、去勢(shì)+E2組和去勢(shì)+2ME組ROS水平無(wú)明顯變化。
　　7、各組大鼠肺組織中MnSOD蛋白和mRNA表達(dá)

12、:去勢(shì)組、假手術(shù)+低氧組、去勢(shì)+低氧組、去勢(shì)+低氧+E2組、去勢(shì)+低氧+2ME組表達(dá)水平均顯著低于假手術(shù)組，且去勢(shì)+低氧+E2組相較于去勢(shì)+低氧+2ME組降低明顯，去勢(shì)+E2組、去勢(shì)+2ME組變化不明顯。
　　結(jié)論:
　　1、長(zhǎng)期持續(xù)低氧環(huán)境下，大鼠血清中ROS水平明顯增高，血清中SOD、Cu/ZnSOD活性明顯降低，大鼠肺組織中MnSOD蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低。
　　2、去勢(shì)組大鼠血清中ROS水平增高，SOD

13、、Cu/ZnSOD活性降低，肺組織中MnSOD蛋白和mRNA表達(dá)均降低。
　　3、與假手術(shù)+低氧組和去勢(shì)組大鼠相比，低氧環(huán)境下的去勢(shì)大鼠ROS水平顯著增高，血清中SOD、Cu/ZnSOD活性顯著降低，肺組織中MnSOD蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低。
　　4、17-β雌二醇和2-甲氧基雌二醇均可抑制ROS水平，增加MnSOD的活性及表達(dá)，從而有益于維持氧化/抗氧化平衡，減輕氧化應(yīng)激水平，緩解肺動(dòng)脈高壓。且2ME在增加MnSOD表