二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)作為慢性阻塞性肺病(chronic obstructivepulmonary disease，COPD)的重要并發(fā)癥之一，直接影響了COPD患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。然而目前對(duì)于COPD相關(guān)PH尚無(wú)療效可靠的預(yù)防和治療措施。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為COPD肺血管床毀損、由低氧導(dǎo)致的肺血管收縮和血管重構(gòu)是引起PH形成的主要機(jī)制，然而在治療上基于此理論而給予的治療手段包括氧療

2、、血管擴(kuò)張劑及現(xiàn)有的用于治療PH的藥物和治療手段并不能逆轉(zhuǎn)COPD相關(guān)PH的持續(xù)進(jìn)展。因此我們必須重新審視COPD相關(guān)PH的發(fā)病機(jī)制，探索肺血管重塑的潛在致病因素，以期尋找早期有效的防治方法。
　　80-90％COPD患者與吸煙有關(guān)，研究證實(shí)吸煙致COPD患者的早期無(wú)低氧階段，甚至在肺功能正常階段，就已經(jīng)出現(xiàn)了肺血管重構(gòu)的現(xiàn)象;長(zhǎng)期吸煙的PH患者中，其血循環(huán)中炎癥因子包括白介素（IL-6）、腫瘤壞死因子(TNF-a)、單核細(xì)胞趨化

3、蛋白-1(MCP-1)等，和平均動(dòng)脈壓有較強(qiáng)的直線相關(guān)性，高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平可作為肺動(dòng)脈高壓的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。這些證據(jù)充分闡明了，在慢性阻塞性肺病患者合并PH的肺血管重構(gòu)過(guò)程中，吸煙所引起的肺血管的慢性炎癥扮演了重要的角色。肺血管重構(gòu)是PH的基本病理特征，其中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smoothmuscle cell，PASMCs)表型轉(zhuǎn)化-從收縮型（分化）向合成型（未分化）轉(zhuǎn)化（分化標(biāo)志物

4、SMA， SM22α等下調(diào)或消失是PASMCs表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志），是獲得異常增殖/遷移、合成分泌能力致肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈高玉形成的前提和基礎(chǔ)，盡管目前已公認(rèn)香煙致慢性炎癥在肺血管重構(gòu)中的關(guān)鍵地位，但涉及其中的確切機(jī)制并未闡明，尤其是香煙暴露下調(diào)控PASMC表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵信號(hào)機(jī)制尚不清楚。
　　調(diào)控細(xì)胞能量代謝平衡-腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)正作為調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)

5、的重要靶點(diǎn)備受關(guān)注。眾多的研究證據(jù)顯示，機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥反應(yīng)程度的變化與AMPK活性改變有密切的關(guān)系，AMPK活性上調(diào)可明顯抑制炎癥反應(yīng)和基體高氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而起到保護(hù)基體組織的作用。臨床上廣泛使用的降糖藥物二甲雙胍(metformin)是AMPK激活劑，2009年Agard等的研究顯示二甲雙胍抑制野百合堿和低氧誘導(dǎo)的PH形成，此項(xiàng)研究雖然未直接探討其機(jī)制，但推測(cè)其機(jī)制可能與AMPK激活有關(guān)。Isoda等對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及

6、巨噬細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過(guò)AMPK抑制NF-κB激活從而降低IL-1β誘導(dǎo)的IL-6等炎癥促進(jìn)因子的表達(dá)水平;提示二甲雙胍可能通過(guò)活化AMPK，引起AMPK磷酸化發(fā)揮抗炎作用。
　　基于上述研究結(jié)果，我們推測(cè)AMPK失活可能是吸煙COPD患者肺血管重構(gòu)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，二甲雙胍上調(diào)AMPK活性有望抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，阻止肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓形成。本研究擬通過(guò)原代培養(yǎng)SD(Sprague Dawley)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)

7、胞，觀察二甲雙胍對(duì)尼古丁(nicotine)誘導(dǎo)的PASMCs增殖的影響，并探討其可能機(jī)制，最終為吸煙所致COPD相關(guān)相關(guān)的防治提高新策略。
　　目的：
　　1、明確不同濃度尼古丁對(duì)PASMCs增殖的影響
　　2、明確二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響;
　　3、明確二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs釋放IL-6、TNF-α及ROS生成的影響;
　　4、探討二甲雙胍對(duì)尼古丁暴露下PASMCs中AMPK

8、表達(dá)和活性的影響。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)材料:
　　雄性SD大鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、PASMCs的原代培養(yǎng)及鑒定;
　　2、CCK-8法檢測(cè)不同濃度的尼古丁對(duì)PASMCs增殖的影響;
　　3、CCK-8法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響;
　　4、ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)尼古丁干預(yù)PASMCs后IL-6和TNF-α釋放及二甲雙胍干預(yù)后IL-6和

9、TNF-α釋放水平變化;
　　5、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性氧(ROS)水平
　　6、Western blot檢測(cè)PASMCs中AMPK蛋白的表達(dá)和活性變化;
　　結(jié)果：
　　1、光鏡下可見(jiàn)，第3代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，典型的“峰-谷”樣生長(zhǎng)。免疫熒光染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)α-actin蛋白FITC標(biāo)記的熒光二抗染成綠色，呈與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的絲狀分布，經(jīng)DAPI染色的胞核為藍(lán)色;
　　2、0.1μmol/L尼古丁促PASMC

10、s增殖效應(yīng)最強(qiáng)(P＜0.05)，2 mmol/L二甲雙胍干預(yù)后能顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的PASMCs增殖(P＜0.05);
　　3、0.1μmol/L尼古丁可明顯促進(jìn)PASMCs中IL-6、TNF-α釋放，在6h時(shí)達(dá)峰值;二甲雙胍處理后在6h時(shí)能顯著降低IL-6、TNF-α的釋放水平(P＜0.05);
　　4、0.1μmol/L尼古丁可顯著誘導(dǎo)PASMCs中 ROS的生成，在1h時(shí)達(dá)峰值(P＜0.05)，隨后開(kāi)始下降。而加入二甲

11、雙胍干預(yù)1h后ROS的生成水平明顯降低(P＜0.05);
　　5、0.1μmol/L尼古丁處理PASMCs1 h時(shí)，磷酸化AMPK水平顯著升高，隨后逐漸減低，而在各時(shí)相點(diǎn)AMPK表達(dá)水平無(wú)明顯變化。而加入二甲雙胍預(yù)處理PASMCs后，PASMCs中磷酸化AMPK水平在尼古丁處理1h、6h、12h、24 h均持續(xù)活化，12h后磷酸化AMPK水平明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、0.1μmol/L尼古丁誘導(dǎo)P