內(nèi)毒素對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮能力的影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分內(nèi)毒素對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮能力的影響
　　[目的]敗血癥休克情況下主要表現(xiàn)為體循環(huán)壓力的下降和早期肺循環(huán)壓力的升高，甚至肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討高濃度的LPS是否導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cell，PASMC)本身收縮能力的變化。【方法】通過(guò)急性消化酶分離法獲得單個(gè)PASMC，在200倍倒置顯

2、微鏡下，灌流含10μg/ml LPS的生理鹽溶液，通過(guò)細(xì)胞長(zhǎng)度的變化、完成收縮所需時(shí)間的變化觀察LPS對(duì)PASMC的直接刺激作用。對(duì)LPS預(yù)處理的PASMC，分別給予80mM高鉀溶液、苯腎上腺素及內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)，觀察LPS對(duì)PASMC的收縮能力的影響。【結(jié)果】(1)本實(shí)驗(yàn)采取的急性消化酶法獲得的PASMC存活率>95％，PASMC純度達(dá)97.7±1.78％。(2)10μg/ml的LPS不能直接引起PAS

3、MC收縮反應(yīng)。(3)80mM的高鉀等滲溶液可引起PASMC收縮，經(jīng)10μg/ml LPS預(yù)處理10min，PASMC對(duì)80mM高鉀等滲HBSS溶液的反應(yīng)更敏感，表現(xiàn)為高鉀刺激后2.5min(68.43±1.46 vs47.70±5.70，P<0.001)、5min(75.42±0.87 vs63.45±3.65，P<0.01)、10min(80.23±0.57 vs74.01±2.17，P<0.05)時(shí)點(diǎn)收縮幅度較對(duì)照組明顯增大。LPS

4、預(yù)處理的PASMC完成50％(1.03±0.10 vs2.38±0.36，P<0.01)及90％(4.04±0.31 vs7.14±0.75，P<0.001)總收縮長(zhǎng)度所用時(shí)間較對(duì)照組顯著縮短。(4)10μM及1mM的苯腎上腺素均不能引起PASMC收縮；LPS預(yù)處理后，10μM的苯腎上腺素也不能引起PASMC收縮。(5)10nM的ET-1作用于PASMC，約1min左右，PASMC發(fā)生迅速而強(qiáng)烈的收縮。經(jīng)10μg/ml LPS預(yù)處理10

5、min，PASMC對(duì)10nM的ET-1的收縮反應(yīng)沒(méi)有明顯的增強(qiáng)或抑制作用(P>0.05)?！窘Y(jié)論】10μg/ml的LPS不能直接引起PASMC收縮，經(jīng)LPS預(yù)處理后對(duì)80mMK誘發(fā)的收縮反應(yīng)表現(xiàn)為增敏作用，而對(duì)ET-1誘發(fā)的收縮反應(yīng)無(wú)明顯影響。
　　第二部分 LPS對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響及其與鈣庫(kù)操縱性鈣通道關(guān)系
　　[目的]旨在探討LPS對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth mu

6、scle cell，PASMC)內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響及其與鈣庫(kù)操縱性鈣通道(SOC)的活性和表達(dá)的關(guān)系。[方法]經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential canonical，TRPC)被證實(shí)是SOC的主要分子基礎(chǔ)，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)正常及LPS刺激后SD大鼠肺動(dòng)脈平滑肌上TRPC1、3、4、5、6 mRNA的表達(dá)。通過(guò)鈣離子熒光探針及共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察LPS對(duì)血管收

7、縮劑引起的PASMC細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i變化、鈣釋放(calcium release)和鈣內(nèi)流(calcium entry)的影響。通過(guò)非選擇性SOC阻滯劑SKF-96365、選擇性SOC阻滯劑2-APB、電壓操縱性鈣通道阻滯劑硝苯地平和ET-1的受體阻滯劑BQ-123，觀察SOC引起的鈣內(nèi)流在PASMC興奮活動(dòng)中的地位。[結(jié)果](1)TRPC1、3、4、5、6在肺動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和尾動(dòng)脈上均有表達(dá)，相互之間無(wú)顯著性差異，P>0.05。10

8、μg/ml LPS孵育10min后，肺動(dòng)脈上 TRPCI(1.21E-05±0.01E-05 vs3.82E-05±0.46E-05，P<0.001)、TRPC3(1.34E-05±0.17E-05 vs6.29E-05±0.15E-05，P<0.001)、TRPC4(1.36E-05±0.15E-05 vs7.46E-05±0.11E-05，P<0.001)的表達(dá)顯著性升高。(2)10μg/mlLPS刺激后，肺動(dòng)脈上ETA-R(1.3

9、1E-05±0.23E-05 vs5.26E-05±0.15E-05，P<0.01)、ETB-R(1.44E-05±0.10E-05 vs3.43E-05±0.20E-05，P<0.001)的mRNA的表達(dá)明顯升高；而α1-腎上腺素受體mRNA的表達(dá)顯著降低(3.16E-05±0.10E-05 vs0.72E-05±0.29E-05，P<0.001)。(3)10μg/ml LPS預(yù)處理PASMC10min后，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i無(wú)可檢測(cè)

10、性變化(0.01±0.01 vs0.01±0.02，P>0.05)，80mM高鉀溶液(0.95±0.06 vs1.25±0.10，P<0.05)及10nM的ET-1(1.56±0.07 vs1.98±0.09，P<0.05)引起的PASMC細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i增幅均較對(duì)照組明顯增高。(4)10μg/ml LPS預(yù)處理的PASMC鈣釋放較對(duì)照組降低(1.36±0.07 vs1.66±0.06，P<0.01)，而鈣內(nèi)流較對(duì)照組增多(1.32

11、±0.10 vs1.06±0.07，p<0.05)。(5)SOC通道依賴(lài)的鈣內(nèi)流在ET-1引起的PASMC激動(dòng)作用占有重要作用，SOC通道的阻斷劑SKF-96365和2-APB分別可阻斷73.0％和70.8％的PASMC的激活作用。[結(jié)論]LPS預(yù)處理的PASMC細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i無(wú)可檢測(cè)性變化，但可使血管收縮劑引起的[Ca2+]i的增幅增大，[Ca2+]i增幅的增大主要來(lái)源于鈣內(nèi)流的增加。LPS可能通過(guò)上調(diào)SOC(即TRPC)通道的