抵抗素樣分子-β調(diào)控FAK信號傳導通路促進人肺動脈血管平滑肌細胞增殖的機制研究.pdf

1、第一部分抵抗素樣分子-β刺激下黏著斑激酶、生存素在人肺動脈血管平滑肌細胞增殖中的表達變化及三者在信號通路中的關系
　　目的：
　　1)觀察不同濃度人抵抗素樣分子-β（resistin-like molecule-β，RELM-β）對體外培養(yǎng)的人肺動脈平滑肌細胞中黏著斑激酶（focal adhesion kinase， FAK）、生存素（survivin）表達的影響；
　　2）觀察RELM-β、FAK、survivin三

2、者之間的關系，探討RELM-β調(diào)控FAK信號通路促進HPAMSCs增殖的機制。
　　方法：取材肺癌周圍的正常組織,體外培養(yǎng)至第5-6代。將細胞隨機分為4組：control組（對照組），重組人RELM-β（recombinant human RELM-β，rhRELM-β）25ng/ml組，50ng/ml組，100ng/ml組。RT-PCR檢測FAK及survivin mRNA表達水平。WB檢測FAK及survivin的蛋白表達量，

3、免疫熒光觀察FAK在HPASMCs中的定位表達，PI單染流試細胞術檢測細胞周期。同時，構(gòu)建FAK和survivin的siRNA，分別轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HPASMCs內(nèi)。RT-PCR分別檢測FAK、survivin mRNA表達水平。以了解RELM-β對HPASMCs中FAK、survivin表達的影響，
　　結(jié)果：與對照組比較,不同濃度rhRELM-β刺激 HPASMCs，其FAK、survivin mRNA及蛋白表達均顯著增高，于

4、50ng/ml組最為顯著（P<0.01)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)。rhRELM-β明顯升高了HPASMCs S期細胞比例，同時降低了HPASMCs G0/G1期比例。FAK siRNA能下調(diào)HPASMCs survivin mRNA表達水平，而survivin siRNA未能下調(diào)HPASMCs中FAK的mRNA表達水平。
　　結(jié)論：RELM-β促進人肺血管平滑肌細胞增殖的同時,也上調(diào)了HPASMCs中FAK、

5、survivin的表達。FAK siRNA能抑制survivin在HPASMCs中的表達，反之不然，說明FAK在細胞增殖信號傳導通路中位于survivin上游，且兩者均在RELM-β誘導的HPASMCs異常增殖過程中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分RELM-β信號通路卷入FAK-survivin信號通路促進人肺動脈平滑肌細胞增殖機制的研究
　　目的:探討FAK-survivin信號通路在RELM-β刺激下人肺動脈平滑肌細胞增殖中

6、的作用。
　　方法:進行人肺動脈平滑肌細胞的原代培養(yǎng)。根據(jù)本實驗室研究結(jié)果，選擇rhRELM-β濃度(50nmol/ml)進行實驗，探討在相同濃度下的延時效應。將細胞分為2組：control組，RELM-β重組蛋白50nmol/ml組。于1、2、4、8h收集細胞， WB檢測FAK和pFAK、survivin蛋白表達水平。于48小時流式細胞術PI單染法檢測細胞周期的分布及FITC-AnnexinV/PI雙染色雙變量流式細胞分析細胞凋

7、亡率。同時，構(gòu)建FAK的siRNA，轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HPASMCs內(nèi)以降低 HPASMCs中FAK的表達，并以rhRELM-β刺激培養(yǎng)HPASMCs，實時定量RT-PCR檢測FAK和survivin mRNA表達水平。Western blotting檢測FAK和pFAK、survivin的蛋白表達水平。使用BrdU摻入法流式細胞術檢測細胞增殖情況。
　　結(jié)果:在體外培養(yǎng)的人肺動脈平滑肌細胞中，F(xiàn)AK siRNA有效抑制了RELM-