整合子—耐藥基因盒系統(tǒng)介導(dǎo)食源微生物耐藥機制的研究.pdf

1、為了探討第一類整合子在食源性細菌耐藥機制中的介導(dǎo)作用,對來自廣州市健康食品從業(yè)人員分離到的23株沙門氏菌做第一類整合子的篩選.首先研究了它們對10種常用抗生素耐藥性情況.結(jié)果表明所有的菌株對其中至少一種抗生素產(chǎn)生耐藥.應(yīng)用PCR法和菌落雜交方法檢測第一類整合子,發(fā)現(xiàn)4株第一類整合子陽性菌株,以IN-F和IN-B對其整合的耐藥基因盒進行擴增,并對擴增片段進行序列分析.結(jié)果表明,在4株第一類整合子陽性菌株中,2株各產(chǎn)生一個1009bp片段,

2、1株產(chǎn)生一個1664bp片段,1株產(chǎn)生1009bp和1664bp兩個片段.序列分析結(jié)果表明,1009bp為aadA2耐藥基因盒,對鏈霉素和壯觀霉素產(chǎn)生耐藥.1664bp含有aadA5和dfr17兩個耐藥基因盒,分別對鏈霉素、壯觀霉素和甲氧氨芐嘧啶耐藥.為了研究第一類整合子的基因定位及其拷貝數(shù),進行了Southern雜交實驗和質(zhì)粒接合實驗.選擇在第一類整合酶基因intI1無酶切位點的EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ對染色體DNA進行限制性酶切,

3、酶切后的染色體DNA和質(zhì)粒DNA分別與PCR產(chǎn)生的并由地高辛標(biāo)記的intI1探針進行雜交,在質(zhì)粒DNA上無雜交信號.同時在質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移實驗中無接合子產(chǎn)生,說明了第一類整合子不存在于質(zhì)粒DNA上.而染色體DNA的雜交實驗表明了第一類整合子的位置和拷貝數(shù),S.tshiongwe S14和S.tshiongwe S126為2個拷貝,S.tshiongwe S191和S.hadar S87為單拷貝.以4株第一類整合子陽性菌株和4株整合子陰性菌

4、株為研究對象,用任意引物PCR(AP-PCR)和腸桿菌間間隔重復(fù)序列PCR(ERIC-PCR)兩種方法測定DNA指紋圖譜,來分析菌株第一類整合子的特性與基因分型之間的關(guān)系.兩種方法對實驗菌株確定出統(tǒng)一并與第一類整合子特性相關(guān)的基因型,而AP-PCR方法較ERIC-PCR方法比較,在區(qū)分菌體基因型方面能力更強.為研究第一類整合酶基因?qū)δ退幓蚝胁东@和表達的調(diào)控因子和調(diào)控過程,采用了反向PCR方法擴增第一類整合酶基因上游未知的DNA片段.用