細菌整合子捕獲與表達耐藥性基因盒調(diào)控機制的研究.pdf

1、隨著抗生素的廣泛使用,細菌在抗生素的選擇壓力下,耐藥菌株不斷產(chǎn)生。其中通過基因的水平轉(zhuǎn)移,獲得外源性耐藥基因是加快臨床耐藥菌株產(chǎn)生與播散的重要原因。整合子通過位點特異性重組捕獲外源基因盒并使之表達,同時整合子可位于質(zhì)粒上,或自身作為轉(zhuǎn)座子的一個組成部分而參與轉(zhuǎn)移,使耐藥基因發(fā)生播散。目前在整合子中發(fā)現(xiàn)的基因盒已超過80種,大部分是耐藥基因盒,編碼產(chǎn)物可賦予細菌對幾乎全部臨床常用藥物種類產(chǎn)生耐藥性,同一個整合子可變區(qū)可帶有多個耐藥基因盒,

2、使宿主菌對多種藥物產(chǎn)生耐藥性。整合子因其在細菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的重要作用而受到研究者的關(guān)注。
　　有研究表明細菌在不利于其生長的環(huán)境中,可通過SOS反應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控整合酶蛋白的表達,從而影響整合子捕獲基因盒的效率,同時到目前為止,整合酶蛋白催化的基因盒位點特異性重組反應(yīng)體系在體外無法成功構(gòu)建,表明整合子捕獲與表達外源性基因盒存在著某種調(diào)控機制。由于整合子可變區(qū)基因盒中耐藥基因的表達關(guān)系到宿主細菌的耐藥表型,而整合子對耐藥性基因盒的捕

3、獲則關(guān)系到新耐藥菌株的產(chǎn)生與播散,因此對整合子捕獲與表達耐藥性基因盒的調(diào)控機制進行研究,可加深對整合子這一細菌適應(yīng)外界環(huán)境變化的進化平臺的理解,進而有可能開發(fā)出相關(guān)的藥物來下調(diào)或阻止整合子中耐藥基因盒的表達,降低整合子對外源耐藥基因盒的捕獲頻率,從而減少耐藥菌株的產(chǎn)生與播散。
　　基于上述原因,本研究以第1類整合子作為研究對象,通過分子流行病學調(diào)查了解整合子在臨床菌株中的分布情況;由于位于質(zhì)粒上的基因盒的表達水平還與質(zhì)粒的拷貝數(shù)有

4、關(guān),本研究建立了一種快速確定第1類整合子是否位于質(zhì)粒上的方法;然后從整合子自身結(jié)構(gòu),主要是不同可變區(qū)啟動子,對整合子捕獲與表達耐藥性基因盒的調(diào)控機制進行研究;同時建立一種適用于轉(zhuǎn)座子插入突變文庫篩選的、高通量的檢測整合酶介導的基因盒剪切頻率的方法,以便用于進一步尋找宿主細菌中影響整合子捕獲耐藥性基因盒的因素。
　　1、臨床菌株整合子分子流行病學調(diào)查
　　為明確整合子在臨床菌株中的分布情況,同時為后續(xù)研究提供適當?shù)恼献?、基?/p>

5、盒等材料,本研究首先對臨床菌株整合子進行分子流行病學調(diào)查。運用PCR篩查臨床菌株中的第1、2、3類整合子,第1類整合子陽性菌株對整合子可變區(qū)序列進行分析。結(jié)果176株臨床菌株中第1、2、3類整合子陽性率分別為76％(134株)、1％(2株)、0％(0株),134株第1類整合子陽性菌株中有76株成功擴增出可變區(qū),可變區(qū)中最常見的基因盒及排列為dfrA17-aadA5(34株)及dfrA12-orfF-aadA2(26株),同時在一株臨床菌

6、株中發(fā)現(xiàn)并命名了一種新的甲氧芐啶耐藥基因盒dfrA27。表明第1類整合子在臨床菌株中分布廣泛,其可變區(qū)中的基因盒均為賦予宿主菌對甲氧芐啶、氯霉素及早期使用的氨基糖苷類抗生素耐藥,提示整合子對耐藥性基因盒的捕獲與播散需一定的抗生素選擇壓力和時間。
　　2、第1類整合子快速基因定位方法的建立
　　整合子位于質(zhì)粒上,可隨質(zhì)粒的移動而移動,從而加快了耐藥菌株的產(chǎn)生以及耐藥基因的播散,同時位于質(zhì)粒上的整合子中基因盒的表達還與質(zhì)粒的拷貝

7、數(shù)有關(guān),因此,確定整合子及耐藥基因是否位于質(zhì)粒上,對于耐藥基因播散機制的研究及感染控制均十分重要?，F(xiàn)有的基因定位方法均費時且費用高,本研究建立了一種基于實時定量PCR的方法,對臨床菌株中整合子基因定位進行快速鑒定。對于同一細菌標本,分別抽提質(zhì)粒、全基因組DNA或制備菌體煮沸裂解模板,運用實時定量PCR檢測第1類整合酶基因(inI1)與16SrDNA在上述3種模板中的拷貝數(shù),如果整合子位于染色體上,那么intI1拷貝數(shù)與16SrDNA拷貝

8、數(shù)的比值在不同模板中應(yīng)是相同的,相反,如果整合子位于質(zhì)粒上,質(zhì)粒模板中intI1拷貝數(shù)與16SrDNA拷貝數(shù)的比值(Rp)要高于全基因組。DNA或菌體煮沸裂解模板中intI1拷貝數(shù)與16SrDNA拷貝數(shù)的比值(Rg或Rb)。為提高檢測的特異性,將Rp/Rg或Rp/Rb大于4作為判斷整合子位于質(zhì)粒上的標準。運用該方法對12株臨床菌株中的整合子進行定位,結(jié)果該12株細菌中Rp/Rg或Rp/Rb均大于4(5.42-24.48),推測其均有整合

9、子位于質(zhì)粒上。用PFGE結(jié)合探針雜交對12株細菌中整合子基因定位進行確認,結(jié)果該12株細菌中整合子均位于質(zhì)粒上,質(zhì)粒大小為48.5-240kbp不等。為進一步確認該方法可對位于染色體上的基因進行定位,用該方法對10株lacZ基因(位于染色體上)陽性菌株中l(wèi)acZ基因進行定位,結(jié)果該10株細菌中Rp/Rg或Rp/Rb均小于2(0.51-1.77)。與其它基因定位方法相比,該方法具有快速、簡便、費用低、適用范圍廣、可計算整合子所在質(zhì)粒的拷貝

10、數(shù)等優(yōu)點,可廣泛應(yīng)用于對其它基因或。DNA序列進行快速定位。
　　3、第1類整合子中aadA2基因翻譯起始位點的確定
　　由于市場上缺乏相關(guān)的研究抗體,有關(guān)基因盒中基因在翻譯水平的研究的報導較少。aadA2基因是第1類整合子基因盒中最常見的基因之一,編碼產(chǎn)物為29kDa的氨基糖苷-3”-腺苷?；D(zhuǎn)移酶[AAD(3”)],賦予細菌對鏈霉素和大觀霉素耐藥。aadA2基因讀碼框起始部位有兩個起始密碼子ATG和GTG,密碼子GTG上

11、游有核糖體結(jié)合位點被認為是主要或唯一的起始密碼子,但從密碼子ATG起始也能合成一條完整的多肽鏈,但至今并沒有證據(jù)表明在細菌中aadA2基因可從ATG密碼子起始翻譯并合成有功能的蛋白。本研究通過制備抗AAD(3”)蛋白特異性多克隆抗體,對含有不同起始密碼子的aadA2基因翻譯產(chǎn)物進行檢測,結(jié)果證實當位于第1類整合子可變區(qū)第1位基因盒中,aadA2基因在細菌中可從上游不具有核糖體結(jié)合位點的ATG密碼子起始翻譯并合成有功能的AAD(3”)蛋白

12、,這一特性使得通過第1類整合酶介導整合入attI位點的基因盒,不需帶有核糖體結(jié)合位點即可起始基因盒中相應(yīng)讀碼框的翻譯,這更有利于第1類整合子表達從外界環(huán)境中捕獲的基因。
　　4、第1類整合子不同可變區(qū)啟動子對基因盒表達水平的影響
　　第1類整合子中基因盒上游可變區(qū)啟動子是影響基因盒轉(zhuǎn)錄水平的最主要因素之一。國內(nèi)外對于基因盒中基因在翻譯水平的研究大多用報告基因替代原有基因,研究結(jié)果并不能完全代表自然情況下整合子中基因盒在翻譯水

13、平的表達情況。本研究通過構(gòu)建8種含有不同可變區(qū)啟動子的整合子,運用第三部分制備的抗AAD(3”)多克隆抗體,觀察其對下游aadA2基因盒中aadA2基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響。結(jié)果強Pant啟動子聯(lián)合有活性的P2啟動子下游aadA2基因的表達水平最高,比表達水平最低的弱Pant啟動子下游aadA2基因在轉(zhuǎn)錄水平要高出約200倍,在翻譯水平要高出約15倍,并首次檢測了雜合2型Pant啟動子聯(lián)合有活性的P2啟動子下游基因盒中aadA2基因的

14、表達水平,發(fā)現(xiàn)其僅次于強Pant啟動子聯(lián)合有活性的P2啟動子及強Pant啟動子聯(lián)合無活性的P2啟動子。
　　5、第1類整合子不同可變區(qū)啟動子對基因盒整合頻率的影響
　　第1類整合子可變區(qū)啟動子位于基因盒重組位點attI上游,可變區(qū)基因盒在可變區(qū)啟動子的作用下進行轉(zhuǎn)錄時需經(jīng)過attI位點,并使attI位點雙鏈解開,可能影響整合酶蛋白與雙鏈attI位點結(jié)合,從而對整合酶介導的基因盒位點特異性重組產(chǎn)生影響。因此本研究對第1類整合子

15、中不同可變區(qū)啟動子對基因盒整合頻率的影響進行研究。運用實時定量PCR檢測高表達整合酶的條件下,基因盒插入不同可變區(qū)啟動子下游attI位點的整合頻率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含弱。Pant啟動子的整合子中基因盒的整合頻率最高,是整合頻率最低的強Pant啟動子聯(lián)合有活性P2啟動子的整合子中基因盒整合頻率的74倍,同時發(fā)現(xiàn)整合子中基因盒的整合頻率與P2啟動子種類密切相關(guān),在含有無活性P2啟動子的整合子中基因盒的整合頻率明顯高于含有有活性P2啟動子的整合子,在

16、含有相同P2啟動子的整合子中基因盒的整合頻率與整合子可變區(qū)基因盒的表達水平成負相關(guān)。提示整合子需要基因盒高表達以適應(yīng)外界環(huán)境時,可通過降低整合頻率以維持整合子結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定。
　　6、利用“乳頭狀試驗”檢測基因盒剪切頻率的方法的建立
　　研究表明細菌處于應(yīng)激狀態(tài)下,整合頻率會大大提高,表明不同的外界環(huán)境可影響整合子捕獲基因盒的效率,而外界環(huán)境的變化是通過細菌體內(nèi)不同基因表達水平的變化而影響整合子捕獲基因盒的效率的,因此,宿主

17、菌中可能存在著影響整合子捕獲基因盒效率的因素。轉(zhuǎn)座子插入突變文庫是比較成熟的篩選細菌中影響某一表型或生物學性狀的基因的方法,但現(xiàn)有的檢測整合子中基因盒剪切與整合頻率的方法都不適用于對大規(guī)模轉(zhuǎn)座子插入突變文庫進行高通量篩選。本研究建立一種利用“乳頭狀試驗”檢測整合子中基因盒剪切頻率的方法。Laca基因的讀碼框由于基因盒aadA5的插入而不能翻譯成有功能的β-半乳糖苷酶的α片段,當laca基因讀碼框內(nèi)插入的基因盒aadA5在整合酶蛋白的作用

18、下被剪切下來,laca基因讀碼框能翻譯成有功能的β-半乳糖苷酶的α片段,在大腸桿菌JM109中能發(fā)生α互補現(xiàn)象,由于基因盒aadA5的剪切是在細菌生長過程中發(fā)生的,因此在含X-gal與IPTG的平板上,在長出的白色菌落中會出現(xiàn)基因盒aadA5發(fā)生剪切的細菌生長所形成的藍色斑點,而藍色斑點出現(xiàn)的早晚、數(shù)量的多少與剪切頻率有關(guān),可通過觀察藍色斑點出現(xiàn)的早晚以及計數(shù)白色菌落中藍色斑點的數(shù)量來評價剪切頻率。該方法具有簡便、高通量、費用低等優(yōu)點,