整合子捕獲基因盒效率調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目前細(xì)菌的耐藥性非常嚴(yán)重，尤其是多重耐藥菌株的出現(xiàn)是對(duì)臨床細(xì)菌感染性疾病治療的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。耐單種抗生素的菌株的出現(xiàn)可能在人們的預(yù)料之中，可能是基因突變?cè)斐傻慕Y(jié)果，那么在同一菌株中同時(shí)出現(xiàn)對(duì)多種抗生素的耐藥性，就很難用基因突變來(lái)解釋。現(xiàn)在研究證明遺傳物質(zhì)在菌種內(nèi)以及菌種間的水平傳播，是細(xì)菌獲得新的耐藥性的重要手段。在對(duì)一組來(lái)自社區(qū)并且至少在一個(gè)月未服用抗生素的健康人群進(jìn)行研究，所分離到的大腸桿菌中整合子的出現(xiàn)頻率為15％。Jones等人

2、的研究表明攜帶有整合子的菌株要比不攜帶整合子的菌株更容易產(chǎn)生對(duì)多種抗生素的耐藥性。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)70多種耐藥性基因盒。這些資料說(shuō)明整合子在耐藥基因的水平傳播以及多重耐藥菌株的出現(xiàn)中起重要作用。
　　 整合子在某些情況下通過(guò)捕獲有利的基因盒，比如耐藥性基因盒而獲得生存優(yōu)勢(shì)，但也有可能捕獲某些對(duì)宿主產(chǎn)生毒性的基因盒而造成不利的影響，或者過(guò)度捕獲基因盒而對(duì)宿主菌的繁殖造成一定負(fù)擔(dān)。因此，細(xì)菌的整合子在捕獲外來(lái)基因盒的過(guò)程中，一定有

3、一套完整而又精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，但這一機(jī)制仍未明了。對(duì)于這一機(jī)制的研究，有助于加深理解整合子在耐藥基因的水平傳播中的作用，對(duì)于臨床上開(kāi)發(fā)有效的藥物來(lái)阻斷或延緩這一過(guò)程提供有益的幫助。同時(shí)，為利用整合子捕獲基因盒定點(diǎn)、定向的特性，將其開(kāi)發(fā)為一種基因重組工具奠定基礎(chǔ)。為此，我們將從四個(gè)方面研究影響整合子捕獲基因盒的因素，分別是宿主因子、基因盒本身，主要是基因盒長(zhǎng)度、外界環(huán)境因素，主要是抗生素的濃度、整合酶表達(dá)水平。
　　 1.測(cè)定整合子

4、捕獲基因盒效率的新方法的建立以前廣泛使用的測(cè)定整合酶所催化的重組反應(yīng)的效率，是利用接合實(shí)驗(yàn)用表型篩選的辦法來(lái)進(jìn)行。這種方法操作麻煩、費(fèi)時(shí)、相對(duì)的精密度低，不便于整合子捕獲基因盒機(jī)制的深入研究。因此我們建立了一種基于熒光定量PCR技術(shù)，從分子水平來(lái)測(cè)定整合頻率的方法。首先我們用pUC19為載體構(gòu)建了高表達(dá)整合酶的重組質(zhì)粒pUCINT，隨后我們?cè)趐ACYC184載體的不同位置分別插入了整合子以及aadA2基因盒，該重組質(zhì)粒命名為pACINA

5、D，將這兩種相容的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，過(guò)夜培養(yǎng)后用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定發(fā)生整合作用的整合子的拷貝數(shù)和總的整合子的拷貝數(shù)，前者除以后者即為整合頻率。結(jié)果在大腸桿菌BL21(DE3)宿主中所測(cè)得的整合頻率為1.87×10-4，CV值為24.6％，而在沒(méi)有整合酶高表達(dá)的情況下的背景整合頻率低于5.23×10-8。該方法的建立為后續(xù)深入研究整合子捕獲基因盒的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.宿主因子對(duì)于整合效率影響的

6、研究現(xiàn)有資料提示，整合子在捕獲基因盒的過(guò)程中可能還有其它宿主因子的參與，目前還沒(méi)有這方面的具體研究。為此我們利用轉(zhuǎn)座子，對(duì)同時(shí)含有重組質(zhì)粒pUCINT和pACINAD的大腸桿菌BL21(DE3)，建立插入突變文庫(kù)。利用前述方法對(duì)該突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，找到一株整合頻率較其相應(yīng)野生株提高26倍的突變株，將其命名為TIM。利用大腸桿菌基因芯片對(duì)該突變株和其相應(yīng)野生株表達(dá)有差異的基因進(jìn)行篩選，結(jié)果檢測(cè)到表達(dá)有差異的基因共有52個(gè)，其中上調(diào)基因33

7、個(gè)，下調(diào)基因19個(gè)。涉及到原噬菌體DLP12共有8個(gè)，這些基因表達(dá)均上調(diào)，它們分別為ybcT、peaD’、ybcW、exoD’、ybcX、nohB、renD’、ybcV。這引起了我們的重視，因?yàn)楝F(xiàn)有資料也表明存在于眾多細(xì)菌染色體上的原噬菌體，與我們所研究的整合子同樣是細(xì)菌基因組進(jìn)化的重要工具。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)上述部分基因的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與基因芯片的檢測(cè)數(shù)據(jù)相符。進(jìn)一步的研究表明ybcV、ybcW和nohB基因?qū)φ戏磻?yīng)具

8、有一定的促進(jìn)作用。
　　 3.基因盒長(zhǎng)度對(duì)于整合效率的影響到目前為止，有關(guān)整合酶介導(dǎo)的對(duì)基因盒的切除和整合作用的確切機(jī)制仍未明了。整合子中存在臨床上所使用的絕大多數(shù)抗生素耐藥性基因，然而其中有關(guān)的基因盒長(zhǎng)度很少超過(guò)1kb。因此我們假設(shè)長(zhǎng)度不超過(guò)1 kb的基因盒是整合酶所催化的重組反應(yīng)的最適底物。為此我們構(gòu)建了一系列攜帶有相同attC位點(diǎn)但長(zhǎng)度不同的基因盒的重組質(zhì)粒。在論文第一部分所建立的方法基礎(chǔ)之上，測(cè)定了整合酶所催化的對(duì)上述不

9、同長(zhǎng)度的基因盒的切除和整合頻率。結(jié)果顯示切除頻率波動(dòng)在3.08×10-2和1.08×10-2之間，而沒(méi)有整合酶高表達(dá)的背景頻率低于2.38×10-7。通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定表明，切除是通過(guò)兩個(gè)attC位點(diǎn)的重組反應(yīng)而發(fā)生。這些數(shù)據(jù)顯示整合酶介導(dǎo)的對(duì)于不同長(zhǎng)度的基因盒的切除頻率差別不大。對(duì)于在質(zhì)粒pACZC上攜帶的基因盒的切除頻率僅為在質(zhì)粒pSA24上攜帶的基因盒的切除頻率的2.4倍，而后者基因盒的長(zhǎng)度大約是前者基因盒的長(zhǎng)度的7倍。反

10、映出整合酶所催化的切除反應(yīng)，對(duì)于基因盒長(zhǎng)度變化不敏感。而對(duì)于上述不同長(zhǎng)度基因盒的整合頻率波動(dòng)在8.18×10-5和1.39×10-6之間，隨著基因盒長(zhǎng)度的增加，整合頻率明顯地降低，基因盒的長(zhǎng)度對(duì)整合酶所催化的整合效率影響較大。這些研究結(jié)果提示，在整合子捕獲基因盒的過(guò)程中，整合作用可能為其限速步驟。同時(shí)我們證明隨著基因盒長(zhǎng)度的增加，基因盒的切除頻率僅輕度降低，而整合頻率則大幅度降低。反映了由整合酶所催化的分子內(nèi)重組反應(yīng)要比分子間重組反應(yīng)容

11、易的多，過(guò)長(zhǎng)的基因盒可能影響整合酶和其DNA底物之間所形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性。
　　 4.抗生素濃度對(duì)于整合效率的影響整合子捕獲基因盒具有隨機(jī)性，在環(huán)境的強(qiáng)大選擇壓力下，最終獲得最有利于宿主菌生存的基因盒排列和組成方式的細(xì)菌被保留下來(lái)。在臨床中所分離到的整合子中的絕大多數(shù)基因盒，都是編碼對(duì)已知抗生素的抗性，這可能與抗生素在臨床上的廣泛使用有關(guān)。但是到目前為止還沒(méi)有整合酶催化的重組反應(yīng)的效率和抗生素濃度的關(guān)系的報(bào)道。為此，我們把在第

12、三位置含有一aadm2基因盒的整合子克隆到質(zhì)粒pACYC184。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化高表達(dá)整合酶的大腸桿菌BL21(DE3)后，加入不同濃度的鏈霉素過(guò)夜培養(yǎng)后，利用論文第一部分所建立的方法測(cè)定aadA2基因盒在attI位點(diǎn)的重組效率。結(jié)果顯示在沒(méi)有整合酶高表達(dá)的情況下的背景頻率低于1.75×10-7。在高表達(dá)整合酶的情況下，aadA2基因盒能夠在整合子的attI位點(diǎn)發(fā)生重組，但重組頻率變化較大，隨著鏈霉素濃度的增加整合頻率從1.97×10-3

13、增加到1.32。表明一定濃度的抗生素能夠影響整合頻率。用Western blotting進(jìn)一步證實(shí)，aadA2基因盒在attI位點(diǎn)的表達(dá)水平大約是其在整合子的第三位置表達(dá)水平的10倍。
　　 5.整合酶表達(dá)水平對(duì)于整合效率的影響如前所述在一定范圍內(nèi)提高整合酶的表達(dá)水平可以使整合頻率顯著提高，但是在此基礎(chǔ)上再進(jìn)一步提高整合酶的表達(dá)水平，是否會(huì)使整合頻率進(jìn)一步提高呢?我們測(cè)定了克隆在pUC19質(zhì)粒上的整合酶基因在不同濃度的IPTG誘

14、導(dǎo)下，所催化的對(duì)基因盒的整合頻率。測(cè)定結(jié)果顯示在不同的誘導(dǎo)劑濃度下，整合頻率并未見(jiàn)顯著的變化。為了更進(jìn)一步證實(shí)這一現(xiàn)象，我們也測(cè)定了克隆在pET28a質(zhì)粒上的整合酶基因在不同濃度的IPTG誘導(dǎo)下，所催化的對(duì)基因盒的整合頻率。測(cè)定結(jié)果顯示在不同的誘導(dǎo)劑濃度下，整合頻率同樣未見(jiàn)明顯的變化。SDS-PAGE顯示克隆在pET28a質(zhì)粒上的整合酶基因經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)明顯提高，最后用Western blotting也證實(shí)了這點(diǎn)。這說(shuō)明整合酶表