多重耐藥大腸埃希菌耐藥基因與整合子相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　 1、對多重耐藥大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)臨床株β-內(nèi)酰胺酶類(β-lactamases，BLs)和氨基糖苷鈍化酶類(aminoglycosidemodifyingenzymes，AMEs)耐藥基因與Ⅰ-Ⅲ類整合子遺傳標(biāo)記基因之間的相關(guān)性進(jìn)行研究；
　　 2、對多重耐藥大腸埃希菌臨床株16SrRNA甲基化酶的基因特征與接合傳遞效率進(jìn)行研究，并探討其與整合子之間的相關(guān)性；

2、　　 3、分析多重耐藥大腸埃希菌耐藥質(zhì)粒譜，確立耐藥基因在質(zhì)粒上的座位。
　　 方法：
　　 1、采用VITEK-GNS藥敏卡測定136株多重耐藥大腸埃希菌對14種抗菌素的敏感性；紙片擴(kuò)散法確認(rèn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumbeta-lactamases，ESBLs)產(chǎn)酶株；PCR法檢測BLs、AMEs相關(guān)耐藥基因及Ⅰ-Ⅲ類整合子遺傳標(biāo)記基因。
　　 2、采用PCR法篩檢136株多重耐藥

3、大腸埃希菌16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD;對陽性菌株作整合酶基因int1、int2和int3檢測，并擴(kuò)增Ⅰ類整合子可變區(qū)插入片段，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序與鑒定所含耐藥基因盒；以陽性菌株為供體菌，耐疊氮化鈉大腸埃希菌J53為受體菌進(jìn)行接合試驗(yàn)，并結(jié)合質(zhì)粒圖譜對16SrRNA甲基化酶基因進(jìn)行初步定位；瓊脂稀釋法測定136株多重耐藥大腸埃希菌株與接合子的MIC值。
　　 3、采用PCR法檢測BL

4、s和AMEs相關(guān)耐藥基因；質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒；低濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)菌質(zhì)粒特征；以標(biāo)準(zhǔn)λDNA經(jīng)HindⅢ酶切后的片段（其分子量分別為23.1，9.4，6.6，4.4，2.3，2.0kb）的電泳結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)，建立回歸方程，換算出質(zhì)粒DNA分子量。
　　 結(jié)果：
　　 1、136株E.coli呈現(xiàn)多重耐藥性，其中，除對AMP和TOB100％耐藥以外，對其他12種抗生素的耐藥率由高到低依次為：GEN99.26％

5、、SXT90.44％、LVX89.70％、CIP88.24％、CFZ82.35％、ATM79.41％、CRO78.68％、SAM76.47％、CAZ69.85％、AMK28.67％、TZP7.35％和IPM0.74％。136株多重耐藥的EcoliESBLs產(chǎn)生率高達(dá)70.59％(96/136)，產(chǎn)酶株對氨芐西林、慶大霉素、妥布霉素、亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦以外的其余9種抗菌素的耐藥率顯著高于非產(chǎn)酶株(P＜0.05)。BLs耐藥基因總

6、檢出率為96.32％(131/136)，1株外膜通道蛋白o(hù)prD2基因缺失，AMEs耐藥基因總檢出率為100％(136/136)，Ⅰ類整合子遺傳標(biāo)記基因qacE△1-sul1的檢出率為94.12％(128/136)，未檢出Ⅱ類與Ⅲ類整合子基因。BLs基因和AMEs基因與qacE△1-sull遺傳標(biāo)記基因的同時(shí)攜帶率分別為90.44％(123/136)和94.12％(128/136)，兩類同時(shí)攜帶率之間的差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

7、，上述兩類耐藥基因與qacE△1-sull遺傳標(biāo)記基因的三者同時(shí)攜帶率為90.44％(123/136)。
　　 2、在136株多重耐藥E.coli中，共檢出16SrRNA甲基化酶陽性菌12株(8.8％)，其中，armA陽性3株(2.2％)，rmtB陽性10株(7.4％)，未檢出rmtA、rmtC、rmtD基因。陽性菌株均只含Ⅰ類整合子，對其可變區(qū)擴(kuò)增片段(1000～2300bp)的測序結(jié)果顯示，該區(qū)域含有多種耐藥基因盒，但不含1

8、6SrRNA甲基化酶基因。接合試驗(yàn)與質(zhì)粒圖譜結(jié)果初步表明armA和rmtB編碼基因位于約23kb的質(zhì)粒上，接合試驗(yàn)的耐藥質(zhì)粒傳遞率高達(dá)83.3％(10/12)。
　　 3、136株多重耐藥E.coli含52類不同譜型的質(zhì)粒群，其中，1型的菌株最多，有18株，約占13.5％；質(zhì)粒數(shù)目為1～9條，質(zhì)粒片段大小在0.3×103bp～99.8×103bp之間，其中，較大質(zhì)粒(23.1kb)出現(xiàn)率高達(dá)86.5％(117/136)。

9、　　 結(jié)論：
　　 136株多重耐藥E.coli臨床株多重耐藥性的形成在BLs基因、AMEs基因與gacE△l-sull遺傳標(biāo)記基因三者之間有密切的相關(guān)性，而與Ⅱ和Ⅲ類整合子無關(guān)。初步證明armA和rmtB編碼基因位于約23kb的質(zhì)粒上，其中，rmtB為優(yōu)勢基因，接合試驗(yàn)和質(zhì)粒圖譜證明該類耐藥質(zhì)粒很容易在同種菌間傳播。Ⅰ類整合子與16SrRNA甲基化酶基因雖然存在于同一菌體內(nèi)和/或同處于一個(gè)質(zhì)粒上，但整合子基因盒對該類基因的捕